头穴丛刺对慢性脑缺血大鼠认知功能障碍及VEGF蛋白表达的影响

孙远征，徐 军，王春霞，许 娜，王雅青

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150001;2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040)

头穴丛刺对慢性脑缺血大鼠认知功能障碍及VEGF蛋白表达的影响

孙远征1，徐 军2，王春霞1，许 娜2，王雅青2

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150001;2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040)

目的:观察头穴丛刺对慢性脑缺血大鼠认知功能障碍及VEGF表达的影响，并探讨其作用机制。方法:采取国内改进的双侧颈总动脉永久性结扎法制备慢性脑缺血大鼠模型，制备成功的大鼠随机分为3组:缺血组、头穴丛刺组、尼莫地平组。Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力，HE染色观察大鼠额叶皮层和海马区的细胞形态变化，免疫组化检查VEGF蛋白表达的情况。结果:与假手术组相比，缺血组大鼠逃避潜伏期明显延长(P＜0.05);与缺血组大鼠比较，头穴丛刺组和尼莫地平组大鼠额叶皮层和海马区VEGF蛋白表达明显增多(P＜0.05)。结论:头穴丛刺法能上调VEGF在慢性脑缺血大鼠中的表达，减轻大鼠的缺血缺氧情况，改善慢性脑缺血大鼠认知功能障碍的状况。

慢性脑缺血;认知功能;头穴丛刺;VEGF

慢性脑缺血作为一种常见的病理状态，是指各种原因引起的长期的脑血流灌注不足的状态。目前研究表明，长期的慢性脑缺血是形成血管性痴呆(VD)的重要因素之一。其发病早期的主要表现是认知功能的损害［1］，最终可能演变为持久或进展性的认知与神经功能障碍。虽然目前针对改善痴呆所致的认知功能的方法有很多，诸如使用脑保护剂，国际上多个循证医学指南推荐使用的尼莫地平来防治痴呆。但药物的长期使用对身体造成了一定的负面影响。于致顺教授依据多年临床经验，采用头穴丛刺治疗脑缺血取得良好效果，但目前为止，利用头穴丛刺治疗慢性脑缺血的研究还较少，本实验本着简便、环保、长期施治的原则，采用头穴丛刺的方法，通过研究VEGF在脑组织中的表达，来探讨头穴丛刺对慢性脑缺血大鼠致认知功能障碍的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组

选用Wistar大鼠60只，体重200～250 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。经过Morris水迷宫筛选后，随机分5笼饲养，选择其中1笼作为假手术组(A组)，其他4笼鼠均进行建模手术。将手术幸存的大鼠进行水迷宫筛选后，随机分成3组:缺血组(B组)、头穴丛刺组(C组)、尼莫地平组(D组)。

1.2 主要试剂和材料

兔抗大鼠HIF－1a抗体、兔抗大鼠VEGF多克隆抗体、二步法免疫组化检测试剂(均购自北京博奥森生物技术有限公司)，Morris水迷宫(安徽淮北正华生物仪器设备有限公司)，Olympus照相显微镜(日本olympus公司)。

1.3 模型建立和标本采集

慢性脑缺血模型制备参照Liu HN［2］改进的双侧颈总动脉永久性结扎法进行。头穴丛刺组(C组)参照《实验针灸学》中大鼠的穴位定位方法取穴［3～5］，选取“百会”及百会左右旁开1 mm共3个点，以30号0.5寸毫针平行向额叶透刺，每天2次，每次同一时段针刺留针30 min，间隔10 min进行捻转行针，200转/ min，每次5 min。尼莫地平组(D组)用0.5%羧甲基纤维素钠溶液溶解尼莫地平(每20 mg尼莫地平溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液100 ml配成0.02%悬浮液)后，按1 mg/kg给予大鼠灌胃处理，每天2次，每次同一时段进行。假手术组(A组)不做任何处理，4周后各组大鼠进行断头处理。

1.4 行为学检测方法

采用Morris水迷宫分别于手术前、手术后4周、及治疗4周后3个时间点对大鼠进行学习记忆能力的测试，包括定向航行和空间探索两部分，重点记录大鼠的逃避潜伏期和撤去平台后大鼠在原象限平台停留的时间。每次持续5天，前4天进行定向航行，第5天进行空间探索。每次每天在同一时间段进行。数据采集及图像分析均由图像自动监视和处理系统完成。

1.5 病理组织学检查

治疗结束后以10%水合氯醛麻醉，固定在实验台上，打开胸腔，先用生理盐水约200～300 ml灌洗，再用4%的多聚甲醛固定，直至动物头部及颈部呈僵硬状态，断头取脑，放入4%多聚甲醛中固定4～6 h，石蜡包埋，作4～6 mm厚度切片。行常规HE染色，用光镜观察各组大鼠额叶皮层及海马的细胞形态学变化;用免疫组化法检测各组大鼠额叶皮层及海马区的VEGF蛋白的表达情况。

1.6 数据处理

用统计软件SPSS16.0处理数据，数据都取均数±标准差(±s)，用方差齐性分析，组间用LSD检验，取P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠学习记忆能力的变化

与假手术组比较，缺血组大鼠学习记忆能力变化明显(P＜0.05)，说明造模成功;治疗后，头穴丛刺组、尼莫地平组相对于缺血组学习记忆能力有了进一步的提高(P＜0.05)，说明介入治疗在一定程度上改善了慢性脑缺血大鼠致认知功能障碍;头穴丛刺组和尼莫地平组比较，P＞0.05，无统计学意义，表明头穴丛刺法在改善慢性脑缺血大鼠致认知功能障碍方面的效果和尼莫地平组一样。见表1、2。

表1 各组大鼠于同一时间段比较逃避潜伏期(±s，单位:s)

表1 各组大鼠于同一时间段比较逃避潜伏期(±s，单位:s)

注:与假手术组比较，*P＜0.05;与缺血组比较，ΔP＜0.05;与尼莫地平组比较，#P＞0.05。

组别 手术前 手术后4周 治疗4周后假手术组35.65±4.09 31.64±3.76 22.62±1.40缺血组 35.02±2.58 45.96±1.94* 40.58±1.52*头穴丛刺组 33.56±3.94 46.59±2.11*Δ# 29.62±2.05*Δ#尼莫地平组 34.30±3.24 46.07±1.78*Δ 30.98±2.17*Δ

表2 各组大鼠于同一时间段比较撤去平台后停留在原平台象限的时间(±s，单位:s)

表2 各组大鼠于同一时间段比较撤去平台后停留在原平台象限的时间(±s，单位:s)

注:与假手术组比较，*P＜0.05;与缺血组比较，ΔP＜0.05;与尼莫地平组比较，#P＞0.05。

组别 手术前 手术后4周 治疗4周后假手术组35.26±3.12 40.25±1.47 49.34±2.32缺血组 35.13±2.38 26.24±1.13* 29.93±1.36*头穴丛刺组 34.78±1.85 25.99±1.31*Δ# 40.67±2.19*Δ#尼莫地平组 33.59±2.19 27.08±1.14*Δ 40.01±1.54*Δ

2.2 HE染色结果

假手术组大鼠额叶皮层见椎体细胞数目多，排列紧凑，染色浅;海马区4至多层细胞染色浅，排列紧密，偶见固缩细胞或基本正常，见封三彩图1。缺血组大鼠额叶皮层椎体细胞数目明显减少，排列疏松，细胞周围间隙明显，形态不规则，呈三角形，胞质染色不均但着色深，有空泡形成;海马区细胞数目明显减少，且层次不清，形态不规则，少量细胞脱落、排列松散，可见大量固缩细胞，胞质染色不均，有空泡形成，核仁显示不清，见封三彩图2。头穴丛刺组和尼莫地平组大鼠额叶皮层椎体细胞数目较多，排列紧凑，形态大体规则，可见少量固缩细胞;海马区细胞轻度减少，细胞排列层次及形态清晰，胞质染色均匀而色浅，可见少量固缩细胞，见封三彩图3、4。

2.3 VEGF蛋白的表达

与假手术组比较，缺血组大鼠额叶皮层和海马区的VEGF表达有了明显的提高，差异有统计学意义(P＜0.05)，表明造模成功;尼莫地平组和头穴丛刺组与缺血组比较，VEGF表达有了更进一步的提高，差异有统计学意义(P＜0.05)，表明介入治疗后一定程度上上调了VEGF的表达;尼莫地平组和头穴丛刺组相比较，两者之间无统计学意义，表明两种方法上调VEGF表达的程度无大的差别。见表3。

表3 不同脑组织VEGF阳性细胞表达情况(±s)

表3 不同脑组织VEGF阳性细胞表达情况(±s)

注:与假手术组比较，*P＜0.05;与缺血组比较，ΔP＜0.05;与尼莫地平组比较，#P＞0.05。

组别 皮层 海马区假手术组0.095±0.012 0.032±0.001缺血组 0.476±0.035* 0.483±0.026*尼莫地平组 0.694±0.028Δ 0.748±0.031Δ头穴丛刺组 0.682±0.031Δ# 0.751±0.021Δ#

3 讨论

长期的慢性脑供血不足产生的慢性脑缺血是一种病理状态，他常伴发于脑动脉硬化、血管性痴呆(VD)、阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)、宾斯旺格(Binswanger disease，BD)和动静脉畸形等多种疾病的病理过程中。近年来对于慢性脑缺血的实验研究及临床研究也逐渐受到关注，相关文献报道层出不穷。研究表明，低灌注及低代谢状态下，大鼠学习记忆能力减退［6］。孙强［7］研究慢性脑供血不足的基础及临床研究也指出慢性脑缺血致认知功能障碍，严重者可导致痴呆。本实验采用国内改进的双侧颈总动脉结扎法制备慢性脑缺血大鼠模型，Morris水迷宫证实术后4周大鼠相比术前学习记忆能力有所减退(P＜0.05)。

慢性脑缺血早期最具特征性临床表现为近记忆力的减退，类似于中医的“痴证”、“呆病”的早期阶段。针对痴证或呆病，传统取穴是依据局部取穴的原理选取百会、四神聪作为主穴，再辨证分型选取配穴。于致顺教授经过多年的临床实践研究，提出于氏丛刺法的观点来治疗脑血管疾病。于氏将头部划分为7个区域，顶区、顶前区、额区、枕区、枕下区、颞区、项区。其中有关学习记忆能力的部分主要分布在额区和颞区。根据以上情况及实验本身的局限，本实验采用百会穴及旁开1 mm的两个点向额区透刺，实验研究结果表明头穴丛刺能改善慢性脑缺血大鼠致认知功能障碍的情况。曹华［8］研究头穴丛刺结合康复训练干预轻度认知功能障碍也取得了较好的疗效。由此推测，头穴丛刺可能诱导了大鼠额区及颞区的脑血流量和血流容积的增加。促进了毛细血管、胶质细胞纤维的增生，抑制了神经元细胞的凋亡坏死。

近年来相关研究表明，VEGF作为血管内皮细胞特异的有丝分裂原，在胚胎的发育、伤口的愈合、炎症、肿瘤、缺血、缺氧等病理过程中发挥着重要的作用。不仅可以诱导内皮细胞增殖、促进微血管形成，还能直接作用于多种类型的神经细胞发挥着神经营养及神经保护作用，可增强细胞活性和存活能力，并能促进轴突再生［9～10］。LI Bao－dong［11］研究头穴丛刺对大鼠缺血脑组织血管内皮生长因子表达的影响结果表明头穴丛刺法能上调VEGF的表达，促进微血管的新生。

本实验中，缺血组大鼠额叶皮层及海马区的VEGF表达较对照组明显升高(P＜0.05);相比于缺血组，头穴丛刺组和尼莫地平组的VEGF表达又进一步提高(P＜0.05)。同时，HE染色显示头穴丛刺组和尼莫地平组的细胞缺血损伤较缺血组轻。由此可见，VEGF做为一种保护性因子，对慢性脑缺血大鼠有脑保护作用。研究表明慢性脑缺血可持续诱导VEGF表达，说明其在慢性脑缺血的代偿修复过程中发挥重要作用。而头穴丛刺和尼莫地平都能通过上调VEGF的表达来达到脑保护的作用。

综上所述，头穴丛刺法能上调慢性脑缺血大鼠脑额叶皮层和海马区的VEGF的表达，通过诱导内皮细胞的增殖，促进微血管的形成、侧枝循环的建立，抑制神经细胞的凋亡来改善额叶及海马区的血液供应，保护脑组织，改善因缺血缺氧造成的认知功能障碍。因此在针对慢性脑缺血的内科治疗上，寻找到了一条新的出路，避免了长期服用药物所带来的对人体的负面影响。当然，由于实验大鼠的特殊生理构造，在头穴丛刺取穴方面存在一定的局限性，但在临床上可以大胆的取额区及颞区进行头穴丛刺观察疗效。同时，今后的研究方向也可以向针药结合发展，争取做到短期内取得最大疗效。

［1］孙强.慢性脑供血不足的基础及临床研究［J］.中风与神经疾病杂志，2009，26(6):759－760

［2］Liu HN，Giasson Bl，Mushynski WE，et al.AMPAreeeptor－mediated toxieity in oligodendroeyte Progenitors involves free radieal generation and aetivation of州K，ealpain and easpase3［J］.J Neuroehem，2002，82(2):398－409

［3］Wang LM，YF，TangXC.HuperzineAimproves congnitive deficits caused by chronic cerebral hypoperfusion in rats［J］.Eur J Pharmacol，2000，398 (1):65－72

［4］Solaroglu I，Solaroglu A，Kaptanoglu E，et al.Erythropoietin prevents is－chemia－reperfusion from inducing oxidative damage in fetal rat brain［J］.Childs Nervous System，2003，19:19

［5］李忠仁.实验针灸学［M］.北京:中国中医药出版社，2003:327

［6］John T.O’Brien.Vascular Cognitive Impariment［J］.Am J Ceriatr Psychiratry，2006，14:724

［7］孙强.慢性脑供血不足的基础及临床研究［J］.中风与神经疾病杂志，2009，26(6):756－760

［8］曹华.头穴丛刺结合认知训练对轻度认知功能障碍的影响［J］.针灸临床杂志，2010，26(10):4－6

［9］Stiver SL，Tan X，Brown LF，et al.Vascular endothelial growth factor A angiogenesis induces a stable neovasculature in adult mu－rine brain［J］.J Neuropathology Exp Neurol，2004，63(8):841

［10］Mani N，Khaibullina A，Krum JM，et al.A strocyte grow－th effects of vascular endothelial growth factor(VEGF)applica－tion to perinatal neocortical explants:receptor med iation and sig－nal transduction pathways［J］.Exp Neurol，2005，192(2):394

［11］LI Bao－dong.Impacts on the Expression of Uascular Endothelial Growth Factor in Ischemic Brain Tissue Treated with Closter Puncture on Scalp Acupoints in Rats［J］.WorldJournalof Acupuncture Moxibustion，2008，18(1):38－44

Effect of Cluster Needling of Scalp Point on Cognitive Function and Expression of VEGF in Rats with Chronic Cerebral Ischemia

SUN Yuan－zheng1，XU Jun2，WANG Chun－xia1，XU Na2，WANG Ya－qing2
(1.The Second Affiliated Hosptial of Heilongjiang Univversity of Chinese Medicine，Harbin150001，China; 2.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin150040，China)

Objective:To observe the effect of cluster needling of scalp point on cognitive function and expression of VEGF in rats with chronic cerebral ischemia，and to explore the mechanism.Methods:To make the chronic ischemia model through improved permanent bilateral carotid arteries occlusion.The surviving rats were randomly divided into three groups:the group of ischemia，the group of cluster needling，the group of Nimodipine.To check the ability of leaning and remembering through Morris water labyrinth;to study the morphologic changes with HE staining and the expression of VEGF by immnunohistochemisty method.Results:The escape latency in each trial of the model group were longer than the sham operation(P＜0.05).The expression of VEGF in the cortex of frontal lobe and the hippocampus of rats of the group of cluster Needling and the group of Nimodipine were more than those in the group of ischemia(P＜0.05).Conclusion:The cluster needling of scalp point can reduce the cases of ischemia and anoxia and perfect the state of cognitive impairment through up－regulation the expression of VEGF in rats with chronic cerebral ischemia.

Chronic cerebral ischemia;Cognitive function;Cluster Needling of scalp point;VEGF

R246.6

A

1005－0779(2012)006－0053－04

孙远征(1957－)，男，教授，主任医师，从事针灸的临床研究。

2011－11－04