校准曲线的制作及有关问题的探讨

蔡裕丰，吴春妍

(启东市环境监测站，江苏 启东 226200)

环境监测中的样品分析主要包括滴定分析、称量分析、分光光度分析、仪器分析和生物分析等方法。其中分光光度分析和绝大部分的仪器分析都需通过制作校准曲线来进行样品分析。笔者在日常的质量督查中发现，不少分析人员特别是新上岗人员对于如何制作和使用校准曲线存在许多问题，而现行的监测分析方法又没有详细的介绍。对此，笔者结合多年工作经验，并参阅有关文献，就校准曲线的制作和有关问题作一系统的探讨。

1 校准曲线的定义及制作

校准曲线是指描述待测物质浓度或量与相应的测量仪器响应量或其它指示量之间的定量关系的曲线［1］。制作好校准曲线是取得准确测量结果的基础。校准曲线为该分析方法的直线范围，根据方法的测量范围，配制一系列浓度的标准溶液，较均匀分布在测量范围内。系列点 (包括零浓度点)至少应有6个。最低点和最高点要相差一个数量级，每个浓度点作平行测定，取平均值，减去空白值后包括零浓度点用最小二乘法进行回归，取得回归方程y=a+bx，x一般为μg或μg/ml。校准曲线的制作应与样品分析同时进行。

2 校准曲线的空白试验、相关系数、截距、斜率和线性范围的要求、影响因素

空白试验:在制作校准曲线时必须同时作两个空白试验。空白试验是除用水代替样品外，其它所加试剂和操作步骤均与样品测定完全相同的操作过程。试验用水、试剂质量、器皿、实验室环境及操作过程中的沾污等因素都影响空白试验的测定值(即空白值)。这些影响因素控制好后，每个分析项目的空白值均会在一定范围内波动。一般来说，空白值越小越好。如空白值出现异常，会影响测定结果的准确度，应从上述几方面寻找原因。

相关系数 (γ):表示校准曲线的精密度，分光光度法要求γ≥0.999，否则应查找原因加以纠正，重新制作合格的校准曲线。某些分析项目，由于含量很低或操作中的影响因素较多，如原子吸收中的石墨炉分析，某些气相色谱项目，相关系数可适当放宽，要求γ≥0.99。

截距 (a):表示校准曲线的准确度。影响因素包括容量器具，光度测量仪器的误差 (比色皿的成套性，非单色光引起的偏差，仪器的线性等)、操作误差等，也有方法本身的因素［2］。一般要求a≤0.005，当a＞0.005时，应作截距的显著性检验。A要求保留到小数点后第三位，至少有一位有效数字。

斜率 (b):表示校准曲线的灵敏度。它除了受方法的灵敏度影响外，还与显色反应条件 (如环境温度、显色温度、试验用水、试剂质量、显色溶液的pH值)、标准溶液的准确度、测量仪器的灵敏度、波长的准确度以及分析人员的操作水平等有较大关系。上述这些影响因素控制好，大多数分析项目的斜率能保持在一定的范围内，通常不超过相对偏差2.5%。当发现斜率上移或下降，超出了范围，应从各影响因素中查找。

线性范围:是某分析方法校准曲线的直线部分所对应的待测物质浓度或量的变化范围。线性范围内标准点的吸光度 (A)应控制在0.010～0.080以内，其测量误差较小。同时线性范围不能任意外推。如样品的吸光度超出了线性范围，要重新取样测定。

3 标准曲线与工作曲线的区别

校准曲线包括标准曲线和工作曲线。取不同含量标准溶液，直接加入试剂，显色后进行测定，得出浓度值与信号值的线性关系称为标准曲线。而取不同量标准溶液，经过与样品分析相同的前处理步骤 (如蒸馏、消解、水浴、萃取、振荡等)，由此得出浓度值与信号值之间的线性关系称为工作曲线。如经过试验证实，标准溶液系列在省略部分操作步骤时，直接测量的响应值与全部操作步骤具有一致结果时，可允许省略步骤。总磷［3］、总铬［4］、总铁［5］的工作曲线与标准曲线经实验证实，其斜率间无显著性差异，可以直接使用标准曲线，而对于挥发酚、总氰化物的测定，其工作曲线与标准曲线相比，斜率有所下降，使用标准曲线，结果偏低，因此必须使用工作曲线［6］。

4 校准曲线使用中的注意事项

对于校准曲线斜率稳定的分析项目，批间误差较小，在样品分析中可以使用原校准曲线，但应在样品分析同时，带两个空白试验和一个中间标准点。中间标准点测定值与标准曲线相应点浓度的相对误差不超过10%，否则应重新制作校准曲线。尽管如此，校准曲线也应两个月制作一次。在比色分析中，当仪器条件发生变化 (如调换光源灯泡，仪器波长校正，或仪器经过维修等因素)、标准溶液新配制时，标准曲线也应重新制作。一些仪器如原子荧光、原子吸收、气相色谱、离子色谱等分析的所有项目，因每次测试条件不可能完全相同，要求每次样品分析都要制作校准曲线。

表1 一些常规分析项目校准曲线的斜率范围

5 部分常规分析项目的空白吸光度、斜率范围，以及在质控中的应用

笔者参考有关文献［7，8］，归纳整理了日常分析中21个项目的空白试验吸光度和标准曲线斜率的范围，见表1。对分析人员特别是新上岗人员有较好的参考价值。如分析中空白试验的吸光度出现了异常，校准曲线的斜率达不到要求，都要逐一寻找原因，直到符合要求为止。

笔者曾用火焰原子吸收法测定土壤中的铜、镉、铅、锌、镍，发现这几个项目的空白值都出现不同程度的升高，特别是锌空白值更高。对此现象，进行了详细分析，认为导致空白值升高的原因主要为:①实验用水和消解样品试剂纯度不高;②所用器皿被沾污;③消解过程中样品被尘埃污染;④氢氟酸加入方法不当;⑤消解过程中赶酸不完全。针对上述原因，逐一加以改进，使空白值达到正常水平。再如用4－AAP萃取光度法测定挥发酚时，校准曲线的斜率偏低，应从以下几方面寻找原因:①实验用水是否为无酚水;②苯酚标准溶液的浓度是否准确，因1.00μg/ml的苯酚标准使用液不稳定，配制后2h内使用;③缓冲溶液的pH是否达到要求。因氨－氯化铵缓冲溶液挥发性很大，应定期测定pH值，发现pH不在10.0±0.2范围内，要重新配制;④4－氨基安替比林的提纯和配制方法是否准确。因该试剂易吸潮结块并被氧化，常用CHCL3提纯，如CHCL3用量过大，使该试剂的浓度低于2%;⑤CHCL3的加入量是否准确，CHCL3比重较大且易挥发，要使CHCL3的加入量尽量准确;⑥萃取操作中的萃取频率和萃取时间要一致，确保萃取完全。

校准曲线的制作是个较为复杂的系统工程，各种影响因素错综复杂，例如实验用水不仅能引起空白值的偏高，也可能引起截距和斜率的变化。而且每个分析项目的影响因素又不完全相同，因此要求每个分析人员具体问题具体分析，在制作校准曲线时，勤于思考，认真操作，精益求精。

［1］国家环境保护总局《水和废水监测分析方法》编委会．水和废水监测分析方法 (4版) ［M］．北京:中国环境科学出版社，2003，80－81．

［2］沈叔平．试析环境监测分析中的质量保证［J］．环境监测管理与技术，1992，4(2):45－49．

［3］刘成梅，陈黎军．过硫酸钾消解测定水中总磷标准曲线制备的简化［J］．环境监测管理与技术，1998，10(4):41．

［4］黄蓉蓉．测定水中总铬校准曲线制备的简化 ［J］．环境监测管理与技术，2000，12(5):39．

［5］蔡裕丰．邻菲啰啉直接光度法测定水中总铁 ［J］．环境科学导刊，2009，28(3):104－106．

［6］金筱青．标准曲线与工作曲线在不同分析方法中的使用［J］．环境监测管理与技术，2005，17(4):45．

［7］袁敏、崔桂贤．水质检测项目空白值及校准曲线a、b值参考表［J］．环境监测管理与技术，2008，20(6):69－70．

［8］本书编委会．空气和废气监测分析方法 (4版) ［M］．北京:中国环境科学出版社，2007，112－127．