石油醚浸出-皂化净化-高效液相色谱法测定油茶籽中的苯并（α）芘的研究

莫润宏，汤富彬，丁 明，屈明华，倪张林，沈丹玉，钟冬莲

（中国林业科学研究院亚热带林业研究所，国家林业局经济林产品质量检验检测中心，浙江 富阳 311400）

苯并（α）芘属多环芳烃类物质，由5个苯环构成，具有强致癌作用，且其化学性质稳定，不易降解，易积累，有较大的潜在危害。苯并（α）芘广泛存在于肉类食品、熏烤食品和食用油中，国家标准GB2762-2005和GB2716-2005中规定了熏烤肉和粮食中的苯并（α）芘的限量为5 μg/kg，食用油中的苯并（α）芘的限量为10 μg/kg[1-2]。油茶籽油以其丰富的不饱和脂肪酸、维生素E和微量矿质元素等受到人们青睐[3]，但油茶籽油苯并（α）芘超标事件给我国茶油市场和产业带来了不小的影响。目前，对于油茶籽油加工技术、营养指标及安全指标的研究较多[4-7]，但对作为原料的油茶籽关注薄弱。炒制后的油茶籽能提高初榨时的出油率，但炒制时的高温无疑引入了产生苯并（α）芘的潜在风险[8]，而苯并（α）芘良好的脂溶性将使其比较容易从油茶籽转移到油茶籽油中，直接影响油茶籽油食用安全。

据报道，有关苯并（α）芘的检测方法主要有：比色法、高效液相色谱法、气质联用法和液质联用法等[9-12]，净化方法主要由GPC法、中心氧化铝SPE净化法等[13-14]。油茶籽样品不同于一般低脂样品（如一般肉类样品、蔬菜样品），基质简单；也不同于食用油脂样品，以均一稳定的液体形式存在，性质稳定。油茶籽样品含油量高，还含有色素等其他物质，基质复杂，这给样品前处理及检测带来很大难度。本文提出了一种石油醚浸出-皂化净化-高效液相色谱法测定油茶籽中苯并（α）芘的方法，该法重现性好、灵敏度高、操作简单、结果准确。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters2695液相色谱仪配荧光检测器（美国waters公司），万分位分析天平（梅特勒，上海），恒温水浴锅（科导，上海），超声清洗器（科导，上海），超纯水仪（Milli-Q，美国），旋转蒸发仪（Buchi，瑞士），均质器（IKA，德国）。

石油醚（沸程60～90℃），无水硫酸钠，氯化钠，氢氧化钾，无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），乙腈（色谱纯，TEDAI，美国）。

苯并（α）芘（甲醇）标准品：20 μg/mL（国家标物中心）。

1.2 前处理方法

1.2.1 提 取 称取粉碎后的油茶籽试样25.00 g（精确至0.01 g）于250 mL磨口平底烧瓶中，加100 mL石油醚，用均质器均质2 min后，超声提取30 min，取出，装上旋转蒸发仪（45℃）挥发至干。

1.2.2 净 化 在提取完的磨口平底烧瓶中加入100 mL 2 mol/L氢氧化钾乙醇溶液，85℃水浴冷凝回流皂化1 h，取出冷却。将皂化液通过塞有棉花的漏斗，转移至500 mL分液漏斗，加50 mL饱和氯化钠溶液，加石油醚，萃取 3 次（50、50、30 mL）。合并萃取液于250 mL分液漏斗中，用超纯水洗至中性。将石油醚相通过无水硫酸钠滤入250 mL磨口平底烧瓶中，在50℃水浴条件下旋转蒸发至干，加入2 mL乙腈清洗烧瓶内壁，复溶苯并（α）芘，过0.22 μm有机相膜待测。

1.3 色谱及检测器条件

色谱柱：多环芳烃（PAH）C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm柱）；流动相：乙腈∶0.5%磷酸溶液（V/V，95∶5）；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：20 μL[15]。荧光检测器条件：激发波长384 nm，发射波长406 nm。

2 结果与讨论

2.1 提取条件选择

提取时选择石油醚为提取剂，利用苯并（α）芘较强的脂溶性，将其从油茶籽中提出。油茶籽中的油脂也会随即提出，有利于下步皂化。传统提取方法主要通过索氏抽提法，提取时间一般为4～12 h，耗时较长。采用均质后，超声辅助提取，能大大缩短提取时间，提取效果良好[16-17]。

2.2 净化条件选择

净化油脂方法多采用GPC净化和中性氧化铝SPE柱净化，但GPC净化所用仪器昂贵，中性氧化铝SPE柱在油脂含量较高时净化作用不明显。利用苯并（α）芘不溶于水且对酸碱稳定的性质，采用氢氧化钾乙醇溶液皂化的方法，除去油脂，达到净化目的。

2.3 方法学验证

2.3.1 方法的定量下限（LOQ） 在空白样品中，添加低浓度的标样，按照峰面积信噪比大于10（S/N＞10）进行计算，得到苯并（α）芘的定量下限为0.1 μg/kg，满足国标检测限量要求。

2.3.2 标准曲线及线性范围 准确吸取苯并（α）芘（甲醇）标样1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到2000 μg/mL苯并（α）芘母液。吸取母液0.5 mL于10 mL容量瓶中，氮气吹干，用乙腈溶解定容，得100 μg/mL标准储备液。分别取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL于10 mL容量瓶，用乙腈定容，得1.0、2.0、5.0、10、20 μg/mL 标准使用液。依次从低浓度到高浓度进样20 μL，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。在1.0～20 μg/mL内线性良好，标准曲线方程：y=112 391 x+48 692，R2=0.999。

2.3.3 方法精密度和回收率 在空白样品中，分别加入不同浓度的苯并（α）芘标准储备液，按建立的提取净化方法操作并检测，选择苯并（α）芘1.0、10、20 μg/kg 3个添加水平，计算苯并（α）芘平均回收率及相对标准偏差（n=6），见表 1。结果表明，在 1.0、10、20 μg/kg 3个添加水平时，苯并（α）芘的平均回收率为84.0%～94.0%，相对标准偏差在4.29%～8.26%间，准确度和精密度均达到残留分析的要求。

表1 苯并（a）芘添加回收率试验结果（n=6）

2.3.4 实际样品测试 对实际炒焦的10批油茶籽样品进行检测，2批炒焦油茶籽样品中检出含有苯并（α）芘，含量分别为 0.32、0.64 μg/kg。标样及样品色谱图见图1。

图1 苯并（α）芘标样及油茶籽样品检测色谱图

3 结论

本研究建立了一种石油醚浸出-皂化净化-高效液相色谱法测定油茶籽中苯并（α）芘含量的检测方法。方法相对偏差为4.29%～8.26%，加标平均回收率为84.0%～94.0%，结果表明该方法精密度好，准确性高，检测所用试剂成本低，操作简单，完全适用于油茶籽中苯并（α）芘的测定。

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