刘慧萍 ,尤昭玲 ,张国民 ,刘春燕 ,王宏宝 ,肖 艺 ,吴 霞 ,庄 乔 ,黄珍琦 ,雷 磊 *
(1.湖南中医药大学分子病理与药理实验室,湖南 长沙 410208;2.湖南中医药大学湘杏学院2008级中西医结合专业,湖南 长沙 410007)
补肾活血方对免疫性卵巢早衰小鼠卵泡凋亡相关蛋白的影响
刘慧萍1,尤昭玲1,张国民1,刘春燕1,王宏宝1,肖 艺1,吴 霞1,庄 乔2,黄珍琦2,雷 磊1*
(1.湖南中医药大学分子病理与药理实验室,湖南 长沙 410208;2.湖南中医药大学湘杏学院2008级中西医结合专业,湖南 长沙 410007)
目的 研究补肾活血方对卵巢早衰(POF)小鼠卵泡凋亡调控相关基因的表达,为临床中医药预防和治疗卵巢早衰提供思路。方法 采用透明带3作抗原,对BALB/c雌性小鼠皮下多点注射,建立免疫性POF模型。用补肾活血方低、中、高剂量进行治疗,设倍美力为阳性对照药,采用ELISA法测定外周血清抗透明带抗体(AzpAb)的含量,进行脏器指数及卵巢病理学观察,免疫组织化学SABC法检测卵泡凋亡调控基因(bcl-2/Bax)表达变化。结果 与空白组比较,模型组AzpAb表达明显增高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,各剂量组、倍美力组表达均明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);与空白组比较,模型组卵巢指数、胸腺指数均明显下降,脾脏指数明显增加,差异有统计学意义(P<0.01),与模型组比较,高剂组和倍美力组卵巢指数(P<0.01)、胸腺指数(P<0.05)增加,脾脏指数降低(P<0.05);与空白组比较,模型组bcl-2蛋白表达明显下降、Bax蛋白表达显著增加,差异有统计学意义(P<0.01),与模型组比较,各剂量组、倍美力组bcl-2蛋白表达明显增高(P<0.01),Bax蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论 补肾活血方可能通过调节凋亡调控基因(bcl-2/Bax)的表达,使AzpAb表达明显下降,从而调节免疫反应,抑制抗体集聚,阻止卵泡的过度凋亡,改善卵巢的免疫功能,使有生机卵泡增加,淋巴细胞、浆细胞浸润减少,达到抑制自身免疫损伤、保护卵巢、改善卵巢功能的目的。
补肾活血方;卵巢早衰;自身免疫;卵泡凋亡;抗透明带抗体;小鼠;补骨脂;紫石英;菟丝子
卵巢早衰(Premature Ovarina Failuer,POF)是由多种病因导致的卵巢功能衰竭,可导致不孕及绝经等症状,严重影响广大妇女的健康[1]。西医对该病的治疗以雌激素为主,但长期使用雌激素副作用大,使患者难以接受。中医药治疗本病副作用较小[2],积极探索中医药防治POF的有效方法,开辟一条安全、有效和经济的新途径非常必要。本实验通过观察小鼠卵巢病理形态、卵泡凋亡调控基因(bcl-2/Bax)表达和外周血AzpAb含量变化,探讨补肾活血方对调节卵巢免疫反应、改善卵巢功能的机制。现将实验方法及结果报道如下。
1.1.1 动物 健康雌性Balb/c小鼠60只,体质量(20±0.2)g,SPF 级,8 周龄, 广东省医学实验动物中心提供,合格证:2008A023。在湖南中医药大学实验动物中心IVC笼具分笼喂养,自由饮水摄食,保持每天12 h明、12 h暗环境。
1.1.2 药物 补肾活血方:补骨脂、紫石英、菟丝子、生熟地、桑寄生、覆盆子、山萸肉、土鳖虫、水蛭、鸡内金、路路通、泽泻、泽兰、桔梗、乌药、甘草,由湖南中医药大学第一附属医院中药房提供。倍美力:惠氏制药有限公司。
1.1.3 试剂 小鼠透明带多肽溶液:小鼠透明带3(ZP3)第330-342个氨基酸序列(NSSSSQFQIHGPR),分析纯度>90%,杭州中肽生化有限公司,批号:P00105。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂:美国 Sigma公司,批号:F5881、F5506。 小鼠抗透明带抗体酶联免疫分析试剂盒:美国USCNLIFE公司,96例/份。bcl-2、Bax免疫组化试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司,批号:AB112-1、AB026-1。
1.1.4 仪器 LEICA DM LB2型双目显微镜(德国LEICA公司),MIAS医学图像分析系统 (北航公司),Shandon325型石蜡切片机(英国 Shandon公司),Motic B5显微摄像系统(麦克奥迪实业集团公司)等。
1.2.1 模型制备 取6 mg zp3透明多肽粉,加入6 mL双蒸水配成溶液,与弗氏完全佐剂按1∶1配制成免疫试剂,与弗氏不完全佐剂按1∶1配制成免疫强化试剂。每只小鼠给予0.15 mL免疫试剂注射双后脚掌处及腹腔皮下,14 d后予免疫强化试剂0.15 mL再次注射双后脚掌处及腹腔皮下加强免疫。空白组予0.15 mL生理盐水注射双后脚掌处及腹腔皮下。
1.2.2 分组及给药方法 空白组造模后50只小鼠随机分为模型组、倍美力组、补肾活血方低、中、高剂量组(以下简称为低、中、高剂量组),每组10只。给药剂量均按“60 kg成人体表面积换算,临床成人用药剂量的1、2、4倍,补肾活血方煎成浓缩剂,分别含生药 0.54、1.08、2.16 g/mL。 倍美力:0.625 mg/片,0.625 mg/d,用冷开水溶解,制成溶液,含倍美力0.002 mg/mL。造模后1周开始灌胃,倍美力组予倍美力溶液0.3 mL,空白组和模型组均予等量生理盐水;补肾活血方低、中、高剂量组分别予补肾活血方混悬液 0.3 mL(含生药0.54、1.08、2.16 g/mL),连续给药60 d(每周休息1 d)。
1.2.3 AzpAb检测 小鼠眼球采血,离心,取血清,采用ELISA法测定AzpAb含量,具体方法见试剂盒。
1.2.4 卵巢、胸腺、脾脏指数测定 小鼠眼球采血后,颈椎脱臼处死,取双侧卵巢、胸腺、脾脏于电子天平称重,计算脏器指数(脏器指数=脏器质量/体质量)。
1.2.5 免疫组化染色 卵巢标本修整3 mm×5 mm,迅速于4%多聚甲醛液固定20 min,4℃于DEPC处理30%蔗糖液过夜至沉,取出于异戊烷-液氮法速冻。冰冻切片机切片,载玻片清洗、硅化、多聚赖氨酸包被。按免疫组化试剂盒方法检测各组bcl-2和Bax蛋白定性和定量,包括标本处理(脱水、浸蜡、包埋)、切片及贴片、脱蜡和染色。免疫组化SABC法检测bcl-2和Bax,具体操作按说明书。
1.2.6 图像分析 光镜下400倍放大,经显微摄像系统随机摄取5个视野,定位阳性区域在细胞表达的位置,采用计算机图像分析系统对bcl-2和Bax进行定量,阳性区域着色呈棕黄色,用平均灰度值表示阳性细胞区域,灰度值越小,说明阳性反应程度越高,表达越强。
所有数据采用SPSS 17.0软件包进行统计学分析,计量资料用“”表示,单因素方差分析P<0.05为差异有统计学意义。
观察小鼠精神状态、活动度、饮食、二便、毛发光泽度等均正常。
空白组、补肾活血方各剂量组、倍美力组与模型组比较表达均显著下降(P<0.01);高剂量组与倍美力组比较,表达下降,差异无统计学意义(P>0.05),中、低剂量组明显高于倍美力组(P<0.01);补肾活血方各组比较,高剂量组较中、低剂量组表达显著下降(P<0.01)。结果显示,造模后,AzpAb表达显著增加,给药后,分别均能使AzpAb表达显著下调,与模型组比较有显著性差异,说明中西药均能在一定程度上使AzpAb表达下降。结果见表1。
表1 各组小鼠血清AzpAb表达水平比较 ()
表1 各组小鼠血清AzpAb表达水平比较 ()
注:与空白组比较#P<0.01;与模型组比较**P<0.01;与高剂量组比较△P<0.01。
组 别 n 药物剂量(g/kg) AzpAb(pg/mL)空 白 组 10 — 10.07±2.75模 型 组 10 — 70.71±10.47##低剂量组 10 8.1 50.12±8.66**△△中剂量组 10 16.2 44.02±6.08*△△高剂量组 10 32.4 21.83±4.14*△倍美力组 10 3×10-5 26.76±4.48*
卵巢指数:模型组与空白组比较,卵巢指数显著下降(P<0.01);补肾活血方高剂量组、倍美力组与模型组比较,显著增加(P<0.01),补肾活血方低、中剂量组虽有增加,但二者差异无统计学意义(P>0.05);补肾活血方高剂量组与倍美力组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
胸腺指数:模型组与空白组比较,胸腺指数显著下降(P<0.05);药物各组与模型组比较,均增加,高剂量组和倍美力组显著增加(P<0.01);高剂量组与倍美力组比较,虽有增重,但差异无统计学意义(P>0.05)。
脾脏指数:模型组与空白组比较,脾脏指数显著增加(P<0.01);各给药组与模型组比较,均有下降,高剂量组和倍美力组显著下降(P<0.01)。结果见表2。
表2 各组小鼠卵巢指数、胸腺指数、脾脏指数比较(n=10,)
表2 各组小鼠卵巢指数、胸腺指数、脾脏指数比较(n=10,)
注:与空白组比较**P<0.01;与模型组比较★★P<0.01。
组 别 药物剂量(g/kg) 卵巢指数 胸腺指数 脾脏指数空 白 组 — 0.082 5±0.012 7 0.034 0±0.007 4 0.072 2±0.012 3模 型 组 — 0.055 8±0.009 3**0.022 2±0.009 9**0.111 9±0.019 7**低剂量组 8.1 0.058 4±0.008 0 0.025 0±0.003 5 0.097 6±0.016 2中剂量组 16.2 0.059 9±0.007 5 0.025 5±0.005 4 0.097 5±0.013 6高剂量组 32.4 0.077 6±0.012 6★★ 0.032 9±0.007 7★★ 0.089 2±0.015 6★★倍 美 力 3×10-5 0.073 5±0.012 6★★ 0.032 3±0.008 3★★ 0.089 4±0.020 7★★
免疫组化染色结果显示:各组小鼠卵泡均表达bcl-2和Bax蛋白,阳性区域呈棕黄色反应。空白组、补肾活血方各剂量组、倍美力组与模型组比较,bcl-2表达明显增加,Bax表达显著下降,差异均有统计学意义(P<0.01),说明模型组卵泡颗粒细胞有异常凋亡趋势和条件。补肾活血方和倍美力抑制凋亡的作用,可能是通过上调bcl-2表达,下调Bax表达而实现。结果见表3,图1、2。
表3 各组小鼠卵泡颗粒细胞bcl-2、Bax蛋白表达比较(n=10,)
表3 各组小鼠卵泡颗粒细胞bcl-2、Bax蛋白表达比较(n=10,)
注:与空白组比较**P<0.01;与模型组比较★★P<0.01。
组 别 药物剂量(g/kg) bcl-2 Bax空白组 — 18.75±2.99 6.03±2.13模型组 — 1.78±0.88** 32.36±6.01**低剂量组 8.1 10.12±2.14★★ 6.77±1.78★★中剂量组 16.2 15.32±2.19★★ 6.24±1.85★★高剂量组 32.4 15.68±2.16★★ 5.53±1.20★★倍美力组 3×10-5mg/kg 16.21±2.01★★ 4.82±1.39★★
图1 卵巢组织bcl-2蛋白免疫组化染色图(×400)
图2 卵巢蜕膜组织Bax蛋白免疫组化染色图(×400)
中医学无卵巢早衰的专门记载,可归属中医的“血枯”、“血隔”、“闭经”、“月经后期”、“脏燥”、“不寐”、“不孕”等。本病的病因病机主要为肾虚胞阻,治疗原则主要是补肾通络。尤昭玲教授经长期临证观察[3-4],自拟补肾活血方,该方由补骨脂、紫石英、菟丝子、生地黄、熟地黄、桑寄生、覆盆子、山萸肉、土鳖虫、水蛭、生鸡内金、路路通、泽泻、泽兰、乌药、桔梗、甘草等十八味药组成,主治肾虚胞阻型卵巢早衰。该方配伍严谨,用药精当,既符合中医组方特色,又依据现代医学方法,切中病机,共奏补肾通络之功效[5]。本病是肾阴肾阳同时虚损所致,故方中重用紫石英温补肾阳,熟地黄平补肾阴,两药合为君药;补骨脂、菟丝子、生地、桑寄生、山萸肉、覆盆子合用为臣药,使肾阴得养,肾阳得化;泽泻、泽兰、生鸡内金、路路通、土鳖虫、水蛭走冲任而活血利水通胞络,祛瘀通滞;桔梗、乌药条畅气机,使气血调达,冲任通畅,月经顺时而下,利于卵子排出,二者合用为佐药;甘草调和诸药为使。现代药理研究发现,紫石英、补骨脂等补肾药有类激素样作用,能改善POF引起的雌激素分泌不足,提高子宫内膜的容受性,改善宫颈粘液的分泌,利于精子通过[6]。补肾阳药具有增加黄体功能,利于早期妊娠。活血化瘀药可使血管扩张,改善器官的血流量和高凝状态,稳定子宫和输卵管的内环境。因此,补肾药与活血化瘀通络药配伍有利于调经和助孕,而其正是将中西病理、病机、药理融会贯通,也正是该方的灵魂所在[7]。
补肾活血方可增加卵巢体积,使卵巢指数升高,增加发育成熟卵泡数量,使卵泡颗粒细胞层增多,卵巢间质淋巴细胞、浆细胞浸润减少。研究发现,颗粒细胞能合成雌激素和孕酮[8],并通过芳香化途径将雄激素转化为雌激素,是卵巢性激素合成的主要场所。根据实验结果推断,补肾活血方的作用机制可能是通过促进颗粒细胞合成,并分泌E2释放入血,发挥生物学效应,同时可促进卵泡、子宫发育,使子宫、卵巢指数增加。胸腺是中枢免疫器官[9],实验研究证实,胸腺缺如者易发生POF,而本实验结果显示补肾活血方能使胸腺指数增加至正常水平,从而可以推测该方调节免疫作用是通过增加胸腺细胞的数量,使胸腺细胞在胸腺内发育的过程中,对自身抗体产生应答的细胞被消除或抑制,从而形成对自身抗原耐受性。表2结果显示:各用药组脾脏指数较模型组减轻,中药各组和阳性对照组组间比较无统计学差异。由此可见,中西药物均有恢复脾脏功能,使之趋于正常的作用。补肾活血方能双向调节脾脏功能,既可使亢进的脾脏功能下降,又可使降低的脾脏功能增强,故能使脾脏功能恢复正常,调节和改善免疫功能,但其双向调节的作用机制有待进一步研究。
bcl-2是凋亡抑制基因,与Bax共同形成异源二聚体,从而调节细胞凋亡。bcl-2基因是细胞凋亡潜在的抑制基因,可调节细胞凋亡,Bax与bcl-2基因有45%同源性,二者能够形成异源或同源二聚体,细胞存活或是凋亡由bcl-2/Bax比例所决定[10-11]。免疫性卵巢早衰模型小鼠卵泡颗粒细胞bcl-2基因表达明显减少,Bax表达显著增多,bcl-2/Bax系统平衡失调,细胞毒性T细胞水平下降,使Tc通过bcl-2/Bax途径杀伤活化的同种异体特征性B细胞,使其功能下降,从而抑制免疫应答的效应减弱,难以有效去除过度激活的免疫活性细胞,B细胞凋亡减少,使AzpAb等抗卵巢抗体集聚,导致卵巢免疫性损伤,引起卵巢功能下降,甚至衰竭[12]。补肾活血方可以通过调节bcl-2/Bax系统平衡,协调免疫反应及细胞毒性淋巴细胞功能,改善B细胞功能,抑制AzpAb等抗卵巢抗体集聚,使卵巢免疫炎性反应减轻,从而改善卵巢功能[13]。
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(本文编辑 彭芝配)
Effects of Bushen Huoxue decoction on follicle apoptosis-related protein of immune premature ovarian failure in mice
LIU Hui-ping1, YOU Zhao-lin1, ZHANG Guo-min1, LIU Chun-yan1, WANG Hong-bao1,XIAO Yi1, WU Xia1, ZHUANG Qiao2, HUANG Zhen-qi2, LEI Lei1
(TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410208,China)
Objective To study the efffects of Bushen Huoxue decoction on premature ovarian failure(POF)of follicle apoptosis-related protein expression in mice and provide ideas for clinical prevention and treatment of POF with Chinese medicine.Methods The zona pellucida 3 as the antigen,the BALB/c female mice,were given multi-point injectionin subcutaneous immunization to induce the models of autoimmune POF.Then the mice were treated with Bushen Huoxue decoction in low-dose,medium-dose,high-dose and Premarin(as control),respectively.Ovarian index,thymus index,spleen index and the morphology of ovary tissue were studied.The follicle apoptosis-relatedregulatory protein(Bcl-2/Bax)expression was detected by immunohis to chemistry SABC and serum AzpAb content was measured by ELISA.Results Compared with model group,the ovarian index and thymus index were increased(P<0.01,P<0.05),and spleen index was decreased(P<0.05)in Bushen Huoxue decoction high-dose group and Premarin group;the ovarian index and thymus index were increased and spleen index was decreased in Bushen Huoxue prescription median-dose group and low-dose group,but there were no significant differences.Bcl-2 protein expression in the control group,Bushen Huoxue prescription all dose groups,Premarin group were significantly higher than that of modeling group(all P<0.05).While Bax protein and AzpAb expressions in the control group,Bushen huoxue decoction in all dose groups,Premarin group were significantly lower than that in model group(P<0.05).Conclusion Bushen Huoxue decoction may influence the apoptosis-related regulatory protein(such as Bcl-2 and Bax)expressions,decrease AzpAb expression to improve ovarian function.
premature ovarian failure;Bushen Huoxue decoction;autoimmunity;apoptosis;AzpAb;mice;Psoralea corylifolia;Taxillus chinensis Danser;Cuscuta chinensis Lam
R285.5
A
10.3969/j.issn.1674-070X.2012.05.006.028.04
2011-10-25
国家自然科学基金资助项目(30973771);中国博士后科研基金(2012M511382);湖南省自然科学基金资助项目(11JJ4075);国家教育部高等学校博士学科点专项科研基金(20114323120007);湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(2011-480)。
刘慧萍(1979-),女,湖南会同人,医学博士,副教授,主要从事女性内分泌病症机制研究。
*雷 磊,男,教授,博士研究生导师,Tel:0731-88458252。