补肾活血方对免疫性卵巢早衰小鼠卵泡凋亡相关蛋白的影响

刘慧萍 ，尤昭玲 ，张国民 ，刘春燕 ，王宏宝 ，肖 艺 ，吴 霞 ，庄 乔 ，黄珍琦 ，雷 磊 *

（1.湖南中医药大学分子病理与药理实验室，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学湘杏学院2008级中西医结合专业，湖南 长沙 410007）

补肾活血方对免疫性卵巢早衰小鼠卵泡凋亡相关蛋白的影响

刘慧萍1，尤昭玲1，张国民1，刘春燕1，王宏宝1，肖 艺1，吴 霞1，庄 乔2，黄珍琦2，雷 磊1*

（1.湖南中医药大学分子病理与药理实验室，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学湘杏学院2008级中西医结合专业，湖南 长沙 410007）

目的 研究补肾活血方对卵巢早衰（POF）小鼠卵泡凋亡调控相关基因的表达，为临床中医药预防和治疗卵巢早衰提供思路。方法 采用透明带3作抗原，对BALB/c雌性小鼠皮下多点注射，建立免疫性POF模型。用补肾活血方低、中、高剂量进行治疗，设倍美力为阳性对照药，采用ELISA法测定外周血清抗透明带抗体（AzpAb）的含量，进行脏器指数及卵巢病理学观察，免疫组织化学SABC法检测卵泡凋亡调控基因（bcl-2/Bax）表达变化。结果 与空白组比较，模型组AzpAb表达明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，各剂量组、倍美力组表达均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；与空白组比较，模型组卵巢指数、胸腺指数均明显下降，脾脏指数明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01），与模型组比较，高剂组和倍美力组卵巢指数（P<0.01）、胸腺指数（P<0.05）增加，脾脏指数降低（P<0.05）；与空白组比较，模型组bcl-2蛋白表达明显下降、Bax蛋白表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01），与模型组比较，各剂量组、倍美力组bcl-2蛋白表达明显增高（P<0.01），Bax蛋白表达显著降低（P<0.01）。结论 补肾活血方可能通过调节凋亡调控基因（bcl-2/Bax）的表达，使AzpAb表达明显下降，从而调节免疫反应，抑制抗体集聚，阻止卵泡的过度凋亡，改善卵巢的免疫功能，使有生机卵泡增加，淋巴细胞、浆细胞浸润减少，达到抑制自身免疫损伤、保护卵巢、改善卵巢功能的目的。

补肾活血方；卵巢早衰；自身免疫；卵泡凋亡；抗透明带抗体；小鼠；补骨脂；紫石英；菟丝子

卵巢早衰(Premature Ovarina Failuer，POF)是由多种病因导致的卵巢功能衰竭，可导致不孕及绝经等症状，严重影响广大妇女的健康[1]。西医对该病的治疗以雌激素为主，但长期使用雌激素副作用大，使患者难以接受。中医药治疗本病副作用较小[2]，积极探索中医药防治POF的有效方法，开辟一条安全、有效和经济的新途径非常必要。本实验通过观察小鼠卵巢病理形态、卵泡凋亡调控基因（bcl-2/Bax）表达和外周血AzpAb含量变化，探讨补肾活血方对调节卵巢免疫反应、改善卵巢功能的机制。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雌性Balb/c小鼠60只，体质量（20±0.2）g，SPF 级，8 周龄， 广东省医学实验动物中心提供，合格证：2008A023。在湖南中医药大学实验动物中心IVC笼具分笼喂养，自由饮水摄食，保持每天12 h明、12 h暗环境。

1.1.2 药物 补肾活血方：补骨脂、紫石英、菟丝子、生熟地、桑寄生、覆盆子、山萸肉、土鳖虫、水蛭、鸡内金、路路通、泽泻、泽兰、桔梗、乌药、甘草，由湖南中医药大学第一附属医院中药房提供。倍美力：惠氏制药有限公司。

1.1.3 试剂 小鼠透明带多肽溶液：小鼠透明带3(ZP3)第330-342个氨基酸序列(NSSSSQFQIHGPR)，分析纯度>90%，杭州中肽生化有限公司，批号：P00105。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂：美国 Sigma公司，批号：F5881、F5506。 小鼠抗透明带抗体酶联免疫分析试剂盒：美国USCNLIFE公司，96例/份。bcl-2、Bax免疫组化试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司，批号：AB112-1、AB026-1。

1.1.4 仪器 LEICA DM LB2型双目显微镜（德国LEICA公司），MIAS医学图像分析系统 (北航公司)，Shandon325型石蜡切片机(英国 Shandon公司)，Motic B5显微摄像系统（麦克奥迪实业集团公司）等。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 取6 mg zp3透明多肽粉，加入6 mL双蒸水配成溶液，与弗氏完全佐剂按1∶1配制成免疫试剂，与弗氏不完全佐剂按1∶1配制成免疫强化试剂。每只小鼠给予0.15 mL免疫试剂注射双后脚掌处及腹腔皮下，14 d后予免疫强化试剂0.15 mL再次注射双后脚掌处及腹腔皮下加强免疫。空白组予0.15 mL生理盐水注射双后脚掌处及腹腔皮下。

1.2.2 分组及给药方法 空白组造模后50只小鼠随机分为模型组、倍美力组、补肾活血方低、中、高剂量组（以下简称为低、中、高剂量组），每组10只。给药剂量均按“60 kg成人体表面积换算，临床成人用药剂量的1、2、4倍，补肾活血方煎成浓缩剂，分别含生药 0.54、1.08、2.16 g/mL。 倍美力：0.625 mg/片，0.625 mg/d，用冷开水溶解，制成溶液，含倍美力0.002 mg/mL。造模后1周开始灌胃，倍美力组予倍美力溶液0.3 mL，空白组和模型组均予等量生理盐水；补肾活血方低、中、高剂量组分别予补肾活血方混悬液 0.3 mL（含生药0.54、1.08、2.16 g/mL），连续给药60 d（每周休息1 d）。

1.2.3 AzpAb检测 小鼠眼球采血，离心，取血清，采用ELISA法测定AzpAb含量，具体方法见试剂盒。

1.2.4 卵巢、胸腺、脾脏指数测定 小鼠眼球采血后，颈椎脱臼处死，取双侧卵巢、胸腺、脾脏于电子天平称重，计算脏器指数（脏器指数=脏器质量/体质量）。

1.2.5 免疫组化染色 卵巢标本修整3 mm×5 mm，迅速于4%多聚甲醛液固定20 min，4℃于DEPC处理30%蔗糖液过夜至沉，取出于异戊烷-液氮法速冻。冰冻切片机切片，载玻片清洗、硅化、多聚赖氨酸包被。按免疫组化试剂盒方法检测各组bcl-2和Bax蛋白定性和定量，包括标本处理（脱水、浸蜡、包埋）、切片及贴片、脱蜡和染色。免疫组化SABC法检测bcl-2和Bax，具体操作按说明书。

1.2.6 图像分析 光镜下400倍放大，经显微摄像系统随机摄取5个视野，定位阳性区域在细胞表达的位置，采用计算机图像分析系统对bcl-2和Bax进行定量，阳性区域着色呈棕黄色，用平均灰度值表示阳性细胞区域，灰度值越小，说明阳性反应程度越高，表达越强。

1.3 统计学分析

所有数据采用SPSS 17.0软件包进行统计学分析，计量资料用“”表示，单因素方差分析P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

观察小鼠精神状态、活动度、饮食、二便、毛发光泽度等均正常。

2.2 各组小鼠血清抗透明带抗体（AzpAb）的影响

空白组、补肾活血方各剂量组、倍美力组与模型组比较表达均显著下降（P＜0.01）；高剂量组与倍美力组比较，表达下降，差异无统计学意义（P＞0.05），中、低剂量组明显高于倍美力组（P＜0.01）；补肾活血方各组比较，高剂量组较中、低剂量组表达显著下降（P＜0.01）。结果显示，造模后，AzpAb表达显著增加，给药后，分别均能使AzpAb表达显著下调，与模型组比较有显著性差异，说明中西药均能在一定程度上使AzpAb表达下降。结果见表1。

表1 各组小鼠血清AzpAb表达水平比较 （）

表1 各组小鼠血清AzpAb表达水平比较 （）

注：与空白组比较#P<0.01；与模型组比较**P<0.01；与高剂量组比较△P<0.01。

组 别 n 药物剂量（g/kg） AzpAb（pg/mL）空 白 组 10 — 10.07±2.75模 型 组 10 — 70.71±10.47##低剂量组 10 8.1 50.12±8.66**△△中剂量组 10 16.2 44.02±6.08*△△高剂量组 10 32.4 21.83±4.14*△倍美力组 10 3×10-5 26.76±4.48*

2.3 各组小鼠卵巢指数、胸腺指数、脾脏指数的影响

卵巢指数：模型组与空白组比较，卵巢指数显著下降（P<0.01）；补肾活血方高剂量组、倍美力组与模型组比较，显著增加（P<0.01），补肾活血方低、中剂量组虽有增加，但二者差异无统计学意义（P>0.05）；补肾活血方高剂量组与倍美力组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

胸腺指数：模型组与空白组比较，胸腺指数显著下降（P<0.05）；药物各组与模型组比较，均增加，高剂量组和倍美力组显著增加（P<0.01）；高剂量组与倍美力组比较，虽有增重，但差异无统计学意义（P>0.05）。

脾脏指数：模型组与空白组比较，脾脏指数显著增加（P<0.01）；各给药组与模型组比较，均有下降，高剂量组和倍美力组显著下降（P<0.01）。结果见表2。

表2 各组小鼠卵巢指数、胸腺指数、脾脏指数比较（n=10，）

表2 各组小鼠卵巢指数、胸腺指数、脾脏指数比较（n=10，）

注：与空白组比较**P<0.01；与模型组比较★★P<0.01。

组 别 药物剂量（g/kg） 卵巢指数 胸腺指数 脾脏指数空 白 组 — 0.082 5±0.012 7 0.034 0±0.007 4 0.072 2±0.012 3模 型 组 — 0.055 8±0.009 3**0.022 2±0.009 9**0.111 9±0.019 7**低剂量组 8.1 0.058 4±0.008 0 0.025 0±0.003 5 0.097 6±0.016 2中剂量组 16.2 0.059 9±0.007 5 0.025 5±0.005 4 0.097 5±0.013 6高剂量组 32.4 0.077 6±0.012 6★★ 0.032 9±0.007 7★★ 0.089 2±0.015 6★★倍 美 力 3×10-5 0.073 5±0.012 6★★ 0.032 3±0.008 3★★ 0.089 4±0.020 7★★

2.4 免疫组化检测卵巢组织bcl-2和Bax蛋白表达的影响

免疫组化染色结果显示：各组小鼠卵泡均表达bcl-2和Bax蛋白，阳性区域呈棕黄色反应。空白组、补肾活血方各剂量组、倍美力组与模型组比较，bcl-2表达明显增加，Bax表达显著下降，差异均有统计学意义（P<0.01），说明模型组卵泡颗粒细胞有异常凋亡趋势和条件。补肾活血方和倍美力抑制凋亡的作用，可能是通过上调bcl-2表达，下调Bax表达而实现。结果见表3，图1、2。

表3 各组小鼠卵泡颗粒细胞bcl-2、Bax蛋白表达比较（n=10，）

表3 各组小鼠卵泡颗粒细胞bcl-2、Bax蛋白表达比较（n=10，）

注：与空白组比较**P<0.01；与模型组比较★★P<0.01。

组 别 药物剂量（g/kg） bcl-2 Bax空白组 — 18.75±2.99 6.03±2.13模型组 — 1.78±0.88** 32.36±6.01**低剂量组 8.1 10.12±2.14★★ 6.77±1.78★★中剂量组 16.2 15.32±2.19★★ 6.24±1.85★★高剂量组 32.4 15.68±2.16★★ 5.53±1.20★★倍美力组 3×10-5mg/kg 16.21±2.01★★ 4.82±1.39★★

图1 卵巢组织bcl-2蛋白免疫组化染色图(×400)

图2 卵巢蜕膜组织Bax蛋白免疫组化染色图(×400)

3 讨论

中医学无卵巢早衰的专门记载，可归属中医的“血枯”、“血隔”、“闭经”、“月经后期”、“脏燥”、“不寐”、“不孕”等。本病的病因病机主要为肾虚胞阻，治疗原则主要是补肾通络。尤昭玲教授经长期临证观察[3-4]，自拟补肾活血方，该方由补骨脂、紫石英、菟丝子、生地黄、熟地黄、桑寄生、覆盆子、山萸肉、土鳖虫、水蛭、生鸡内金、路路通、泽泻、泽兰、乌药、桔梗、甘草等十八味药组成，主治肾虚胞阻型卵巢早衰。该方配伍严谨，用药精当，既符合中医组方特色，又依据现代医学方法，切中病机，共奏补肾通络之功效[5]。本病是肾阴肾阳同时虚损所致，故方中重用紫石英温补肾阳，熟地黄平补肾阴，两药合为君药；补骨脂、菟丝子、生地、桑寄生、山萸肉、覆盆子合用为臣药，使肾阴得养，肾阳得化；泽泻、泽兰、生鸡内金、路路通、土鳖虫、水蛭走冲任而活血利水通胞络，祛瘀通滞；桔梗、乌药条畅气机，使气血调达，冲任通畅，月经顺时而下，利于卵子排出，二者合用为佐药；甘草调和诸药为使。现代药理研究发现，紫石英、补骨脂等补肾药有类激素样作用，能改善POF引起的雌激素分泌不足，提高子宫内膜的容受性，改善宫颈粘液的分泌，利于精子通过[6]。补肾阳药具有增加黄体功能，利于早期妊娠。活血化瘀药可使血管扩张，改善器官的血流量和高凝状态，稳定子宫和输卵管的内环境。因此，补肾药与活血化瘀通络药配伍有利于调经和助孕，而其正是将中西病理、病机、药理融会贯通，也正是该方的灵魂所在[7]。

补肾活血方可增加卵巢体积，使卵巢指数升高，增加发育成熟卵泡数量，使卵泡颗粒细胞层增多，卵巢间质淋巴细胞、浆细胞浸润减少。研究发现，颗粒细胞能合成雌激素和孕酮[8]，并通过芳香化途径将雄激素转化为雌激素，是卵巢性激素合成的主要场所。根据实验结果推断，补肾活血方的作用机制可能是通过促进颗粒细胞合成，并分泌E2释放入血，发挥生物学效应，同时可促进卵泡、子宫发育，使子宫、卵巢指数增加。胸腺是中枢免疫器官[9]，实验研究证实，胸腺缺如者易发生POF，而本实验结果显示补肾活血方能使胸腺指数增加至正常水平，从而可以推测该方调节免疫作用是通过增加胸腺细胞的数量，使胸腺细胞在胸腺内发育的过程中，对自身抗体产生应答的细胞被消除或抑制，从而形成对自身抗原耐受性。表2结果显示：各用药组脾脏指数较模型组减轻，中药各组和阳性对照组组间比较无统计学差异。由此可见，中西药物均有恢复脾脏功能，使之趋于正常的作用。补肾活血方能双向调节脾脏功能，既可使亢进的脾脏功能下降，又可使降低的脾脏功能增强，故能使脾脏功能恢复正常，调节和改善免疫功能，但其双向调节的作用机制有待进一步研究。

bcl-2是凋亡抑制基因，与Bax共同形成异源二聚体，从而调节细胞凋亡。bcl-2基因是细胞凋亡潜在的抑制基因，可调节细胞凋亡，Bax与bcl-2基因有45%同源性，二者能够形成异源或同源二聚体，细胞存活或是凋亡由bcl-2/Bax比例所决定[10-11]。免疫性卵巢早衰模型小鼠卵泡颗粒细胞bcl-2基因表达明显减少，Bax表达显著增多，bcl-2/Bax系统平衡失调，细胞毒性T细胞水平下降，使Tc通过bcl-2/Bax途径杀伤活化的同种异体特征性B细胞，使其功能下降，从而抑制免疫应答的效应减弱，难以有效去除过度激活的免疫活性细胞，B细胞凋亡减少，使AzpAb等抗卵巢抗体集聚，导致卵巢免疫性损伤，引起卵巢功能下降，甚至衰竭[12]。补肾活血方可以通过调节bcl-2/Bax系统平衡，协调免疫反应及细胞毒性淋巴细胞功能，改善B细胞功能，抑制AzpAb等抗卵巢抗体集聚，使卵巢免疫炎性反应减轻，从而改善卵巢功能[13]。

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（本文编辑 彭芝配）

Effects of Bushen Huoxue decoction on follicle apoptosis-related protein of immune premature ovarian failure in mice

LIU Hui-ping1， YOU Zhao-lin1， ZHANG Guo-min1， LIU Chun-yan1， WANG Hong-bao1，XIAO Yi1， WU Xia1， ZHUANG Qiao2， HUANG Zhen-qi2， LEI Lei1
（TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410208,China）

Objective To study the efffects of Bushen Huoxue decoction on premature ovarian failure(POF)of follicle apoptosis-related protein expression in mice and provide ideas for clinical prevention and treatment of POF with Chinese medicine.Methods The zona pellucida 3 as the antigen,the BALB/c female mice,were given multi-point injectionin subcutaneous immunization to induce the models of autoimmune POF.Then the mice were treated with Bushen Huoxue decoction in low-dose,medium-dose,high-dose and Premarin(as control),respectively.Ovarian index,thymus index,spleen index and the morphology of ovary tissue were studied.The follicle apoptosis-relatedregulatory protein(Bcl-2/Bax)expression was detected by immunohis to chemistry SABC and serum AzpAb content was measured by ELISA.Results Compared with model group,the ovarian index and thymus index were increased(P<0.01,P<0.05),and spleen index was decreased(P<0.05)in Bushen Huoxue decoction high-dose group and Premarin group;the ovarian index and thymus index were increased and spleen index was decreased in Bushen Huoxue prescription median-dose group and low-dose group,but there were no significant differences.Bcl-2 protein expression in the control group,Bushen Huoxue prescription all dose groups,Premarin group were significantly higher than that of modeling group(all P<0.05).While Bax protein and AzpAb expressions in the control group,Bushen huoxue decoction in all dose groups,Premarin group were significantly lower than that in model group(P<0.05).Conclusion Bushen Huoxue decoction may influence the apoptosis-related regulatory protein(such as Bcl-2 and Bax)expressions,decrease AzpAb expression to improve ovarian function.

premature ovarian failure；Bushen Huoxue decoction；autoimmunity；apoptosis；AzpAb；mice;Psoralea corylifolia;Taxillus chinensis Danser;Cuscuta chinensis Lam

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2012.05.006.028.04

2011－10－25

国家自然科学基金资助项目(30973771)；中国博士后科研基金（2012M511382）；湖南省自然科学基金资助项目(11JJ4075)；国家教育部高等学校博士学科点专项科研基金(20114323120007)；湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(2011-480)。

刘慧萍(1979-)，女，湖南会同人，医学博士，副教授，主要从事女性内分泌病症机制研究。

*雷 磊，男，教授，博士研究生导师，Tel：0731-88458252。