半枝莲多糖清除氧自由基及抗脂质过氧化作用

赵 杰， 官守涛， 孙设宗， 张红梅， 刘兴林

(1.湖北医药学院生化与免疫学实验室，湖北十堰442000;2.湖北医药学院实验动物中心，湖北 十堰442000)

中药半枝莲Herba Scutellariae barbatae为唇形科Labiatae植物半枝莲Scutellaria barbata D.Don的干燥全草［1］，具有清热解毒、散瘀止血、利尿消肿等功效，现代临床多用于治疗癌症、肝炎等疾病，疗效确切［2］。对于半枝莲有效成分的研究多集中于黄酮类成分的研究，而对其中的多糖研究相对较少。近年来随着对植物多糖研究的不断深入，人们发现许多中草药富含活性多糖成分，具有抗衰老、抗肿瘤、抗病毒等多种作用［3-4］，且都与其抗氧化作用密切相关［5］。有文献报道，半枝莲多糖具有增强免疫、体外抑瘤等作用［6-7］。本实验利用优化的水提醇沉工艺提取半枝莲多糖并对其清除氧自由基和抗脂质过氧化作用进行研究，以期为半枝莲多糖和半枝莲资源的深入研究和开发提供实验信息。

1 材料

1.1 药品与试剂 半枝莲采自武当山镇近郊，经湖北医药学院药学教研室鉴定，于40℃烘干后粉碎，过40目筛，备用。试验用邻苯三酚、硫酸亚铁、过氧化氢 (H2O2)、硫代巴比妥酸 (TBA)、三氯乙酸 (TCA)、水杨酸、四氯化碳 (CCl4)等主要试剂均为分析纯。丙二醛 (MDA)购自南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器 ZS83-1型内切式组织匀浆机 (浙西机械厂)，RE—52D旋转蒸发仪 (上海青浦沪西仪器厂)，MDF一382E型超低温冰箱 (日本Sony公司)，722S型分光光度计(上海第二光学仪器厂)，电热恒温水浴锅，回流提取装置，抽滤器等。

1.3 动物 4月龄昆明种小鼠，体质量 (30±2)g，雌雄各半，由本院动物中心提供 ［实验动物生产许可证号:SYXK(鄂)2005-0031］。

2 方法与结果

2.1 受试物的制备 称取干燥粉碎的半枝莲若干，用适量95%乙醇浸泡静置过夜，过滤除去上清液。沉淀物于80℃水浴中将乙醇挥干后，加入20倍体积蒸馏水，于60℃水浴中浸提2 h，连续提取3次，合并浸提液低温静置后离心，上清液浓缩为原体积的1/4后用Savage法脱蛋白;按比例加入无水乙醇，使乙醇终质量分数为80%时多糖析出，低温静置过夜后，4 000 r/min离心10 min，所得沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚反复洗涤3次，透析72 h，真空冷冻干燥，制成多糖含有量为45.7%(蒽酮法)的棕褐色粉末，即半枝莲多糖 (SPS)。准确称取半枝莲多糖2.188 g，溶于100 mL蒸馏水中，制成多糖质量浓度为10 mg/mL的半枝莲多糖溶液，试验时根据需要进行稀释即可。

2.2 对超氧阴离子自由基 (O-2)清除率的测定［8］采用邻苯三酚自氧化法。加50 mmol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5 mL于试管中，25℃保温20 min。各管加入不同质量浓度的半枝莲多糖溶液0.1 mL及25℃保温过的6 mmol/L邻苯三酚溶液0.2 mL，混匀后，25℃准确保温4 min，立即用3 mol/L HCl溶液0.2 mL终止反应，322 nm处测定吸光度A值。受试药调零管将加入邻苯三酚和盐酸的次序颠倒，对照管和对照调零管用蒸馏水代替半枝莲多糖。清除率计算公式如下:

清除率=(ΔA对-ΔA样)/ΔA对×100%，其中 ΔA对为邻苯三酚自氧化速率;ΔA样为加入不同质量浓度的半枝莲多糖后邻苯三酚的自氧化速率。

结果见图1。实验结果表明，半枝莲多糖、维生素C对超氧阴离子的生成均有清除作用，且随着质量浓度的增加作用增强。在较低质量浓度时，半枝莲多糖对超氧阴离子的清除作用强于维生素C。

图1 半枝莲多糖、维生素C对超氧阴离子的清除作用

2.3 对羟自由基 (·OH)的清除率的测定［9］参考Fenton反应体系模型，采用固定时间反应法，反应体系中含8.8 mmol/L H2O21 mL，9 mmol/L Fe2+1 mL，9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1 mL、不同质量浓度的半枝莲多糖溶液1 mL。最后加H2O2启动反应，37℃反应0.5 h，在510 nm下测量各浓度的吸光度。受试药调零管则以蒸馏水代替H2O2，对照管和对照调零管则以蒸馏水代替半枝莲多糖。清除率计算公式:清除率 =(A对-A样)/A样×100%，其中 A对为空白对照液的吸光度，A样为加入半枝莲多糖溶液后的吸光度。

结果见图2。由图2可见，半枝莲多糖和维生素C在实验质量浓度范围内对·OH的清除作用均呈现出良好的量效关系，并且半枝莲多糖清除·OH的能力要优于维生素C。

图2 半枝莲多糖、维生素C对羟自由基的清除作用

2.4 对健康小鼠肝匀浆自发性脂质过氧化的影响［10］健康昆明种小鼠禁食12 h，断头处死。迅速取出肝脏，用4℃生理盐水洗净表面残血，滤纸吸干水分后称质量，用pH7.4的磷酸盐缓冲液 (PBS)在冰浴条件下制成10%肝匀浆，4 000 r/min离心5 min，取上清液用双缩脲法测蛋白质含量，用PBS稀释成蛋白质质量浓度为4 mg/mL的溶液备用。取肝匀浆1.0 mL于试管中，加入1.0 mL不同质量浓度半枝莲多糖溶液，对照组以蒸馏水代替半枝莲多糖溶液，混匀，37℃水浴恒温振荡1.5 h后取出，加10%三氯乙酸2.0 mL，混匀，0.67%TBA 1.0 mL，混匀，沸水浴中反应15 min，取出后流水冷却，以3 000 r/min离心15 min，取上清液在波长532 nm处比色，以空白管调零，测定A值，以A532值表示MDA的水平，MDA的抑制率计算公式:抑制率=(A对照-A样品)/A对照×100%。

丙二醛 (MDA)是脂质过氧化的主要终产物，其含有量的多少直接反应肝细胞受自由基攻击的程度。不同质量浓度半枝莲多糖溶液均可抑制肝匀浆的自发性脂质过氧化反应，并且随着半枝莲多糖溶液质量浓度的增加，抑制率也逐步提高。结果见表1。

表1 对健康小鼠肝匀浆自发性脂质过氧化的影响 (± s，n=5)

表1 对健康小鼠肝匀浆自发性脂质过氧化的影响 (± s，n=5)

注:与对照组比较，*P＜0.01。

组别 终质量浓度/(mg·mL-1)A532抑制率/%0.261±0.013 -维生素C组 0.80 0.137±0.010* 47.51半枝莲多糖组 0.50 0.202±0.008* 22.61半枝莲多糖组 1.00 0.158±0.013* 39.46半枝莲多糖组 1.50 0.135±0.009*对照组-48.28

2.5 对健康小鼠肝匀浆Fe2+-H2O2诱导脂质过氧化的影响［11］方法同2.4项，但反应体系中加6 mmol/L硫酸亚铁0.1 mL和60 mmol/L H2O240 μL，于37℃水浴恒温振荡1.5 h，以A532表示MDA的生成量，并计算抑制率。结果见表2。

由表2可见，半枝莲多糖各剂量组能显著抑制Fe2+-H2O2诱导的健康小鼠肝匀浆脂质过氧化反应，且随着质量浓度的增加抑制率也显著提高。

表2 对健康小鼠肝匀浆Fe2+-H2O2诱导脂质过氧化的影响(±s，n=5)

表2 对健康小鼠肝匀浆Fe2+-H2O2诱导脂质过氧化的影响(±s，n=5)

注:与对照组比较，*P＜0.01。

组别 终质量浓度/(mg·mL-1)A532 抑制率/%对照组-0.885±0.012 -维生素C组 0.80 0.291±0.015* 67.12半枝莲多糖组 0.50 0.729±0.009* 17.63半枝莲多糖组 1.00 0.638±0.011* 27.91半枝莲多糖组 1.50 0.509±0.007*42.49

2.6 对CCl4肝损伤小鼠肝脏MDA水平的影响 50只小鼠随机分为5组，每组10只，分正常组、模型组、半枝莲多糖高、中、低剂量用药组。各组均常规饲料，自由饮水，用药组按体质量50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg半枝莲多糖灌胃，每天1次，连续给药7 d，末次灌胃2 h后，除正常对照组只腹腔注射调和油溶液外，其余各组均腹腔注射0.15%CCl4调和油溶液 (按10 mL/kg体质量计算剂量)，12 h后禁食不禁水，24 h后处死小鼠。迅速取出肝脏并按2.4项下方法制备蛋白质质量浓度为4 mg/mL的肝匀浆备用，按试剂盒要求测MDA的水平。

CCl4肝损伤模型组小鼠肝脏MDA显著升高，与对照组比较差异有显著性 (P＜0.01)说明肝损伤模型是成功的。不同剂量的半枝莲多糖用药组可降低肝匀浆中MDA水平，与模型组比较差异有显著性 (P＜0.01)。结果见表3。

表3 对CCl4肝损伤小鼠肝脏MDA水平的影响(±s，n=10)

表3 对CCl4肝损伤小鼠肝脏MDA水平的影响(±s，n=10)

注:与模型组比较，*P＜0.01。

组别 剂量/(mg·kg-1) MDA/(nmol·mg-1pro)正常组 3.73±1.78*模型组 8.60±3.34半枝莲多糖组 50 4.59±1.80*半枝莲多糖组 100 4.33±1.40*半枝莲多糖组 200 4.36±1.68*

2.7 对CCl4肝损伤小鼠肝匀浆体外Fe2+-H2O2诱导脂质过氧化的影响 取2.6项所制各组肝匀浆1.0 mL置编号试管中，正常组加PBS 0.14 mL，其余各组加6 mmol/L Fe-SO40.1 mL和60 mmol/L H2O240 μL。各管置37℃水浴中保温25 min后，加入10%的三氯乙酸2.0 mL并快速混匀以结束脂质过氧化产物的生成诱导。各管再加入0.67%的硫代巴比妥酸溶液1.0 mL，置沸水中15 min后取出，迅速冷却后离心。取上清液在波长为532 nm处测定各管吸光度值，以A532nm反映MDA水平。计算半枝莲多糖对Fe2+-H2O2诱导的CCl4肝损伤小鼠肝匀浆脂质过氧化-MDA产生的抑制率。

将CCl4肝损伤小鼠肝匀浆中加入诱导剂，通过保温过程中可诱导脂质过氧化物的生成，模型组A532明显的高于对照组，说明诱导肝匀浆产生脂质过氧化物是成功的。不同剂量半枝莲多糖用药组A532与模型组比较明显降低，证明半枝莲多糖进入体内后可被充分吸收利用并对抗自由基，能明显抑制脂质过氧化物MDA产生。结果见表4。

表4 对CCl4肝损伤小鼠肝匀浆Fe2+-H2O2诱导脂质过氧化的影响( ± s，n=10)

表4 对CCl4肝损伤小鼠肝匀浆Fe2+-H2O2诱导脂质过氧化的影响( ± s，n=10)

注:与模型组比较，*P＜0.01。

组别 剂量/(mg·kg-1) A532 抑制率/%正常组 0.217±0.136*模型组 0.665±0.139半枝莲多糖组 50 0.403±0.167* 58.48半枝莲多糖组 100 0.348±0.165* 70.76半枝莲多糖组 200 0.372±0.143*65.40

3 讨论

从中草药中提取活性成分是当前研究的热点，多糖是中草药中重要的活性成分之一。中草药多糖具有增强免疫、抗衰老、抗氧化等方面的作用［3］，临床上无论是免疫性损伤还是炎性损伤都与氧自由基及其引起的脂质过氧化反应密切相关。使用生物抗氧化剂切断过氧化链式反应，可以抑制机体的自由基损伤，从而保持机体最佳健康状态和防治相关疾病，延缓衰老［12］。

氧自由基可促发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，MDA是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，氧化损伤可引起MDA生成量增加。MDA在血清或组织中的水平，则能反应自由基对组织的破坏程度。健康小鼠的肝匀浆在37℃孵育后可自发性的发生脂质过氧化，加入Fe2+-H2O2诱导剂可使脂质过氧化加剧，MDA生成量显著增加。实验结果显示，在其中加入不同质量浓度的半枝莲多糖可显著降低健康小鼠肝匀浆自氧化与Fe2+-H2O2诱导的脂质过氧化产物MDA的生成量，说明半枝莲多糖具有体外抗脂质过氧化作用。然而，体外的实验环境与机体的内环境毕竟不同，半枝莲多糖进入机体经过胃肠道的消化吸收后是否仍具有较强的抗脂质过氧化作用呢?实验以不同剂量的半枝莲多糖给小鼠预防性灌胃7 d后注射CCl4，通过测定肝匀浆中MDA水平及再次进行体外诱导试验的方法探讨半枝莲多糖进入体内后的抗脂质过氧化作用。CCl4所致的化学性肝损伤主要是通过脂质过氧化作用引起的，在过氧化链式反应中产生过量的和·OH等，可无选择性的损伤肝细胞的各个组分［13］。结果显示，半枝莲多糖不同剂量给药组能明显减少CCl4肝损伤小鼠肝脏内MDA的水平，对CCl4肝损伤小鼠肝匀浆体外诱导的脂质过氧化同样有显著的抑制作用。由此说明，半枝莲多糖进入机体后可通过抗脂质过氧化作用来保护机体。

综上所述，半枝莲多糖不仅具有体外清除氧自由基和抑制脂质过氧化作用，而且进入小鼠体内能被充分吸收利用，从而切断过氧化链式反应，保护机体免受氧自由基及其引起的脂质过氧化损伤，是一种有效的抗氧化物质，具有良好的应用前景。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2005年版一部［S］.北京:化学工业出版社，2005:77-78.

［2］邹箴蕾，吴启南.半枝莲的化学成分及药理作用研究进展［J］.时珍国医国药，2005，15(2):149-150.

［3］陈 磐，陈绍瑗，冯懿挺，等.植物活性多糖抗癌活性的研究—抗自由基作用［J］.中国药物与临床，2004，4(8):606-608.

［4］雷学军.清除氧自由基的功能性食品［J］.食品工业，2002，23(3):41-441.

［5］周林珠，杨样良，周井炎，等.多糖抗氧化作用研究进展［J］.中国生化药物杂志，2002，23(4):210-212.

［6］马维坤，仰榴青，吴向阳，等.半枝莲多糖提取工艺及其免疫活性初步研究［J］.江苏大学学报:医学版，2007，17(4):315-318.

［7］王志远，戴 玲，朱业云，等.半枝莲酸性多糖SBPs的纯化、性质及抗氧化活性研究［J］.中草药，2009，40(5):728-731.

［8］静天玉，赵晓瑜.用终止剂改进超氧化物歧化酶邻苯三酚测活法［J］.生物化学与生物物理进展，1995，22(1):84-86.

［9］刘凤喜，李志东，李 娜，等.Fenton法中的羟基自由基的测定技术简介［J］.环境研究与监测，2007，20(4):1-5.

［10］刘 刚，王 辉，张先洲.青藤碱清除氧自由基和抗脂质过氧化作用［J］.中草药，2006，37(1):84-87.

［11］李俊丽，王运强，向长萍.南瓜水溶性多糖的体外抗氧化作用［J］.华中农业大学学报，2007，26(2):256-259.

［12］王克勤.脂蛋白与动脉粥样硬化［M］.北京:人民卫生出版社，1995:417.

［13］孙设宗，卢方安，朱名安，等.镁离子、维生素E对小鼠急性肝损伤的保护作用［J］.中国现代医学杂志，2006，16(3):339-345.