RP-HPLC法同时测定内异消大鼠血浆中各成分

冯彬彬， 张建海， 李金玲， 徐晓玉*

(1.重庆三峡医药高等专科学校，重庆 404120;2.西南大学，重庆 400716)

内异消是本课题组研制开发的用于治疗子宫内膜异位症的中药新药，由川芎、当归、延胡索等药材组成。川芎嗪 (tetramethylpyrazine，TMPZ)是川芎中的一种活性生物碱成分，可以改善微循环，并对心血管疾病有着显著的疗效［1］;阿魏酸 (ferulic acid，FA)是当归、川芎中的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗炎、镇静、抑制血小板聚集及抗血栓形成等作用［2］;延胡索乙素 (Tetrahydropalmatine，TET)是中药延胡索中所含具有镇痛作用的有效成分［1］。对川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素单一成分的HPLC的测定有较多报道［3-9］，但是采用HPLC法同时测定性质差别较大的川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素尚无报道。本实验建立了同时测定川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素的RP-HPLC法，为内异消的质量控制提供实验依据。

1 材料、仪器和药品

1.1 仪器和药品 美国Agilent1200(智能柱温箱;MWV紫外检测器);H1650—W台式微量高速离心机 (长沙湘仪离心机仪器有限公司);EL—204电子天平 ［梅特勒-托利多仪器 (上海)有限公司］;WH—2微型涡旋混合仪 (上海沪西分析仪器厂);Millipore纯水系统。甲醇为色谱纯(购自迪马公司);冰醋酸为分析纯;水为去离子水;阿魏酸对照品 (批号:110773-200611)、川芎嗪对照品 (批号:110817-200305)、延胡索乙素对照品 (批号:110726-200610)(均购自中国药品生物制品检定所);香豆素对照品 (购自Sigma公司);阿魏酸原料药、川芎嗪原料药、延胡索乙素原料药 (购自南京泽朗有限责任公司，纯度均在95%以上)。

1.2 动物 SD大鼠，清洁级，雌性，体质量为 (220±20)g，由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号:SCXK(渝)2007-0001。

2 方法和结果

2.1 对照溶液的配制 取川芎嗪对照品15 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，得川芎嗪贮备液质量浓度为0.15 mg/mL;同样方法配制阿魏酸贮备液质量浓度为0.5 mg/mL，延胡索乙素贮备液质量浓度为0.66 mg/mL;香豆素贮备液质量浓度为0.73 mg/mL，将上述香豆素贮备液稀释至13.687 5μg/mL。

2.2 色谱条件 Agilent SB-C18ODS色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5μm);流动相为甲醇-0.3%冰醋酸 (42∶58);体积流量1.0 mL/min;检测波长280 nm;温度30℃。

2.3 生物样品预处理和测定方法专属性考察 精密吸取大鼠血浆样品100μL，加150μL内标和150μL甲醇，涡旋震荡2 min，沉淀蛋白，10 000 r/min离心5 min，上清液过0.22μm微孔滤膜，取10μL进样，并按2.2项下色谱条件进行分析。按上述血浆样品处理方法处理空白血浆加内标、川芎嗪对照溶液、阿魏酸对照溶液、延胡索乙素对照溶液加内标及灌胃内异消制剂的大鼠血浆样品加内标，分别绘制HPLC色谱图(见图1)。

图1 川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素的专属性考察色谱图

实验结果表明:在2.2项色谱条件下，川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素与内标 (香豆素)及血液内源物质色谱峰分离良好，无明显干扰峰出现，血浆中杂质对药物质量浓度的测定无干扰。说明本色谱条件可行。

2.4 标准曲线及线性范围 精密吸取8份大鼠空白血浆各100μL，分别精密加入50μL不同质量浓度的川芎嗪对照溶液、50μL不同质量浓度的阿魏酸对照溶液、50μL不同质量浓度的延胡索乙素对照溶液和上述相同质量浓度的香豆素内标150μL，制成含川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素各成分分别为0.035 1、0.140 6、0.562 5、1.057 0、2.109 6、4.219 0、8.438 0、16.875 0 μg/mL;0.032 2、0.128 8、0.515 0、1.030 0、2.060 0、4.120 0、8.240 0、16.480 0 μg/mL 和 0.016 1、0.064 6、0.258 3、0.516 5、1.033 3、2.065 0、4.130 0、8.250 0μg/mL的系列质量浓度，按照2.3项进行处理和测定，分别以川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素和内标的峰面积之比与川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素质量浓度做回归方程，绘制标准曲线，得到复方药物各成分的回归方程，川芎嗪为:y=0.031 8x+0.014，r=0.999 6;阿魏酸为:y=0.640 5x－0.068 6，r=0.999 8;延胡索乙素为:y=0.149 1x+0.018 6，r=0.999 5。结果表明，川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素分别在0.035 1～16.875 0、0.032 2～16.480 0μg/mL和0.016 1～8.250μg/mL质量浓度范围内线性关系良好。

2.5 加样回收率试验 精密吸取大鼠空白血浆100μL，分别加入低、中、高不同质量浓度的川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素标准溶液各50μL，再加入150μL相同质量浓度香豆素溶液，每个质量浓度平行3份，配制成川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素质量浓度分别为2.109 6、4.219 0、8.475 0 μg/mL;2.060 0、4.120 0、8.480 0 μg/mL 和 1.133 0、3.854 0、6.780 0μg/mL的3个质量浓度，按2.3项生物样品预处理方法处理，每份样品平行进样3次，代入各自标准曲线分别计算川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素在血浆中的质量浓度，并计算加样回收率。计算结果见表1。

由表1可以看出川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素平均回收率均在80%～120%之间，RSD均小于10%，表明该方法加样回收率符合生物样品要求。

2.6 精密度试验 样品配制同2.5项下方法，每份样品平行进样5次，各以1 d内测得的各物质浓度计算日内精密度，以1周内3次配制测定的各物质计算日间精密度。计算各成分含有量，结果见表2～表4。

表1 川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素的加样回收率 (±s，n=3)

表1 川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素的加样回收率 (±s，n=3)

川芎嗪/(μg·mL－1)平均回收率/%RSD/% 阿魏酸/(μg·mL－1)平均回收率/%RSD/% 延胡索乙素/(μg·mL－1)平均回收率/% RSD/%2.109 6 108.80±0.06 5.85 2.06 113.46±0.07 6.191.133 97.78±0.04 4.05 4.219 104.22±0.06 5.34 4.12 110.43±0.01 0.60 3.854 97.34±0.03 3.36 8.475 96.66±0.02 1.86 8.48 98.77±0.01 1.30 6.780 99.88±0.01 1.39

表2 川芎嗪精密度 (±s，n=5)

表2 川芎嗪精密度 (±s，n=5)

质量浓度/(μg·mL－1)日内日间样品平均质量浓度/(μg·mL－1) RSD/% 样品平均质量浓度/(μg·mL－1) RSD/%2.109 6 2.707 8±0.122 8 4.53 2.800 2±0.358 4 12.8 5.645 6.126 6±0.403 8 6.59 5.744 2±0.395 8 6.89 8.475 8.358 0±0.286 4 3.43 8.451 8±0.280 4 3.32

表3 阿魏酸精密度 (±s，n=5)

表3 阿魏酸精密度 (±s，n=5)

质量浓度/(μg·mL－1)日内日间样品平均质量浓度/(μg·mL－1) RSD/% 样品平均质量浓度/(μg·mL－1) RSD/%2.06 2.570 7±0.209 4 8.15 2.527 5±0.192 8 7.63 5.65 5.413 7±0.175 1 3.24 5.074 6±0.072 2 1.42 8.48 8.360 7±0.186 7 2.23 8.329 7±0.283 2 3.40

表4 延胡索乙素精密度 (±s，n=5)

表4 延胡索乙素精密度 (±s，n=5)

质量浓度/(μg·mL－1)日内日间样品平均质量浓度/(μg·mL－1) RSD/% 样品平均质量浓度/(μg·mL－1) RSD/%1.13 1.374 2±0.074 6 5.43 1.364 4±0.068 8 5.04 3.35 3.558 5±0.351 5 9.88 3.180 0±0.294 6 9.26 5.12 5.287 0±0.245 2 4.64 5.105 3±0.307 6 6.02

由表2、3、4可以看出川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素低质量浓度精密度RSD均小于20%，中、高质量浓度精密度RSD均小于15%，表明精密度良好，符合生物样品精密度要求。

2.7 稳定性实验 精密量取空白血浆100μL，分别加入2.1项下各物质中质量浓度对照溶液，配制成含川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素分别为4.219 0、4.120 0和3.854 0μg/mL质量浓度的生物样品，按照2.3项下方法进行处理，分别于0、2、4、6、8、10、12 h取样测定，求得川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素含有量的RSD分别为5.8%、3.4%、4.5%，表明该液在12 h内稳定。

3 讨论

3.1 中药复方进入体内之后，成分为多成分，所以要确定体内成分含有量须建立体内多成分的测定方法。目前对于川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素3种成分同时测定尚无报道，本实验建立了3种有效成分的同时测定方法，效果令人满意。

3.2 本实验选择相同波长下3种物质的同时测定，采用1种物质作为内标，且流动相选择了常用的甲醇和冰醋酸，省时、省力、高效、降低成本。本方法既可在常规HPLC条件下单独测定川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素的血药浓度，亦可用于同时测定3种成分。

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