安息香醛、香草醛和β-细辛醚对P-糖蛋白功能的影响

杨 洋， 王世祥， 房敏峰， 杨凌鉴， 孟 雪，2， 郑晓晖，2*

(1.西北大学生命科学学院，陕西西安710069;2.深圳清华大学研究院，广东深圳518057)

芳香开窍药物苏合香、安息香、石菖蒲性味辛，入心经，辛香走窜、芳香开窍，提高血脑屏障通透性。苏合香、安息香对D-氨基半乳糖敏化小鼠内毒素致死性攻击具有保护作用［1］，明显延长急性缺氧损伤小鼠的存活时间［2］。石菖蒲具有神经细胞保护和益智健脑作用［3］，能促进羟基红花黄色素A、葛根素、川芎嗪进入脑组织内［4］。苏合香、安息香、石菖蒲均可明显升高正常小鼠脑组织中伊文思蓝含有量［4-5］。但芳香开窍药物开放血脑屏障是否与P-gp外排功能有关，报道较少［5-6］。本研究采用P-gp高表达Caco-2细胞，对苏合香、安息香和石菖蒲有效成分安息香醛、香草醛和β-细辛醚与P-gp外排功能关系进行研究，为揭示苏合香、安息香和石菖蒲开窍醒脑作用机制提供实验依据。

1 材料

1.1 细胞 Caco-2细胞株购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药品与试剂 安息香醛、香草醛、β-细辛醚、罗丹明-123(Rho-123)、四甲基偶氮唑盐 (MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、维拉帕米 (Ver)(美国Sigma-Aldrich公司);DMEM培养基、胎牛血清、0.1%胰蛋白酶和磷酸盐缓冲液(美国GIBCO公司);T25细胞培养瓶、24，96孔细胞培养板 (美国Corning公司);色谱纯乙腈 (美国Fisher公司);实验用水为超纯水 (自制);其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器 CB150型CO2培养箱 (德国 Binder公司);TE2000—U倒置相差显微镜 (日本 Nikon公司);TDL—40B型低温高速离心机 (上海安亭科学仪器厂);高效液相系统为Agilent 1100系列高效液相色谱仪，包括脱气机，二元梯度泵，自动进样器，柱温箱，荧光检测器 (美国Agilent公司);BP221S电子天平 (德国Sartorius公司)。

2 方法

2.1 标准溶液制备 精密称取Rho-123适量，置于5.0 mL的棕色量瓶中，加10%DMSO至刻度，制得质量浓度为3.8 mg/mL的溶液。同法制备质量浓度均为10.0 mg/mL的β-细辛醚、香草醛和安息香醛10%DMSO溶液，备用。

2.2 供试品溶液制备 取细胞培养液1.0 mL，置于5.0 mL琥珀色Eppendorf管中，加入20.0 μL 20%三氯乙酸水溶液沉淀蛋白，涡旋2.0 min，12 000 r/min离心10 min，取出上清液，过0.45 μm水系微孔滤膜，备用。

2.3 细胞培养 将Caco-2细胞接种于T25的细胞培养瓶中，培养基为DMEM高糖培养液，培养基中含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和1%L-谷氨酰胺。置于37℃，5%CO2的培养箱中培养。隔天换液，待细胞生长至80% ～90%时用EDTA、胰酶消化并传代，用30～38代细胞进行试验。

2.4 MTT试验 将处于指数生长期的Caco-2细胞接种于96孔培养板，密度为1×105个/mL，每孔终体积为200 μL。上述条件下培养24 h，吸尽每孔培养液，分别加入含有不同质量浓度的安息香醛、香草醛和β-细辛醚培养液，并设调零孔。37℃培养5 h，每孔加MTT(5 mg/mL)液20.0 μL，继续培养4.0 h，终止培养，弃去上清液，每孔加150 μL DMSO，振荡10 min，将结晶充分溶解。用酶标仪于490 nm处测定各孔的吸光度 (A)，细胞存活率 (%)=实验组A值/阴性对照组平均A值×100%，选取细胞存活率90%的药物浓度作为非细胞毒性浓度。

2.5 药物对P-gp外排功能的影响 将处于指数生长期的Caco-2细胞 (1×105个/mL)接种于24孔培养板，每孔终体积为1.5 mL。培养24 h后，将培养液更换成分别含有1.0 μg/mL安息香醛、香草醛、β-细辛醚和5.0 μg/mL维拉帕米的培养液，培养2 h后加入0.38 mg/mL Rho-123 10.0 μL，继续培养0.5 h或1.0 h，按2.2项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液。

2.6 Rho-123测定

2.6.1 色谱条件 Agilent TC-C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈-水 (1%三乙胺)(35∶65，pH=3.0);体积流量0.8 mL/min;检测波长:Ex=485 nm，Em=546 nm;进样量 20.0 μL。

2.6.2 线性关系及检测限 取细胞培养液1.0 mL，加入Rho-123标准品溶液，制备质量浓度为 0.003、0.015、0.03、0.15、0.3、1.5、3.0 μg/mL的空白细胞培养液加标溶液，按2.2项下方法制备供试品溶液，在拟定色谱条件下进样分析。

2.6.3 回收率和精密度 取细胞培养液1.0 mL，加入Rho-123标准品溶液，配制0.003、0.03、0.3 μg/mL低、中、高3个质量浓度的空白细胞培养液加标溶液各3份，按2.2项下方法制备供试品溶液，在拟定色谱条件下，连续进样测定5次;将上述样品溶液在5 d内重复进样5次。

2.6.4 稳定性实验 配制低、中、高3个质量浓度的空白细胞培养液加标溶液，室温下避光放置4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0 h，按2.2项下方法制备供试品溶液，在拟定色谱条件下进样。

3 结果

3.1 对Caco-2细胞存活率的影响 结果表明，β-细辛醚和香草醛质量浓度为0.01～10.0 μg/mL、安息香醛质量浓度为0.01～50.0 μg/mL、Rho-123质量浓度为 0.38～19.0 μg/mL和维拉帕米质量浓度为1.25～5.0 μg/mL时，对Caco-2细胞无毒性作用，Caco-2存活率均大于90%(见表1、表2)。

表1 安息香醛、香草醛和β-细辛醚对Caco-2细胞存活率的影响(n=6)

表2 Rho-123和维拉帕米对Caco-2细胞存活率的影响(n=6)

3.2 对细胞培养液中Rho-123质量浓度的影响

3.2.1 方法学研究 在拟定色谱条件下进样分析。图1为细胞培养液的HPLC色谱图。Rho-123不受其他物质的干扰，专属性较好。以进样量X(μg)为横坐标，对应峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=1 709.6X+7.84及相关系数 r=0.999 8。由此看出，在0.003～3.0 μg/mL的质量浓度范围内，回归方程线性良好，检出限为0.000 3 μg/mL。0.003、0.03、0.3 μg/mL 低、中、高3 个质量浓度的回收率分别为69.37% ±3.82%、72.33% ±6.75%和70.73%±5.94%，日内精密度RSD分别为3.07%、1.98%和3.18%，日间精密度 RSD分别为6.78%、3.75%和4.31%，稳定性试验 RSD值分别为4.02%、3.57%和6.45%。

图1 样品的HPLC图谱

3.2.2 细胞培养液中Rho-123质量浓度的测定 试验结果表明，加入Rho-123 0.5 h和1.0 h后，安息香醛、香草醛和β-细辛醚孔细胞培养液中Rho-123的质量浓度与对照孔比较明显降低 (见表3)。提示安息香醛、香草醛和β-细辛醚可明显促进Caco-2细胞对Rho-123的摄取。

表3 β-细辛醚、香草醛、安息香醛对细胞培养液中Rho-123质量浓度的影响 (n=10)

4 讨论

P-gp 是ATP-结合盒药物转运体家族中最重要的成员之一，可利用ATP水解的能量将生物毒性物质包括多种药物泵出细胞而达到保护的机体作用。在胃肠道上P-gp的表达从胃、十二指肠到结肠逐渐增加［8］，P-gp在人脑微血管内皮细胞呈高度表达［9］，在腔面膜的表达为脑微血管内皮细胞的17倍、为整个脑组织的400～500倍，而且主要在大脑微血管上皮细胞的腔膜和脉络丛上皮细胞尖端膜有大量的表达［10-11］。在心脏、胆管侧膜与肾近曲小管等部位P-gp亦有表达，成为影响药物的吸收、分布和代谢的重要因素［12］。

苏合香、安息香、石菖蒲“芳香走窜，引经上行”。苏合香、安息香对小鼠生理状态下的血脑屏障具有一定的开放效应，明显升高正常小鼠脑组织中伊文思蓝含有量［5］。石菖蒲可使大鼠血脑屏障内皮细胞之间的紧密连接松弛，增加小鼠大脑内5-羟色胺的含有量，石菖蒲具有抑制Hela细胞膜上P-糖蛋白的药物外排作用，提高血脑屏障通透性可能与挥发油有关，但成分不明［6］。本研究发现，苏合香、安息香和石菖蒲有效成分安息香醛、香草醛和β-细辛醚可明显降低细胞培养液中P-gp底物Rho-123的质量浓度，促进Caco-2细胞对Rho-123的摄取，对P-gp外排功能具有明显的抑制作用。提示抑制P-gp功能为苏合香、安息香、石菖蒲辛香走窜、芳香开窍、提高血脑屏障通透性的作用机制之一。

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