HPLC法测定药物主成分及杂质方法验证探讨

夏振华，井凤鸣，周 艳

苏州第四制药厂有限公司，苏州 215008

HPLC法在药品生产企业使用广泛，其分析方法验证体现了企业的技术水平，同时在新药国内外申报和GMP检查中也非常关键[1-3]，如我国新版GMP[4]不少章节反复强调分析方法应当经过验证或确认。欧洲GMP[5]也要求分析方法要进行验证，所有上市产品按照批准方法进行控制。美国FDA早就提出相应的要求，如2010年10月到2011年9月有14家制药公司由于分析方法验证问题收到了其警告信（其中中国有4家）[6]。本文根据现有的一些分析方法的验证指南，并结合实际就HPLC法的验证操作过程提出一些见解。

1 分析方法验证（Validation）、确认（Verification）和转移（Transfer）的定义

分析方法的验证主要是对新建立的分析方法（如HPLC）进行一系列的测定，以考察测定的结果始终符合预期目的过程。

而确认系指已有的药典方法、药政部门批准的和一些文献发表的经过验证的方法，主要是考察由于不同的分析实验室的实际操作条件、不同制剂配方和不同原料药工艺下能否适用，同时验证的方法也未必是最好的方法，包括药典方法。

方法转移适用于企业之间或大公司的不同实验室之间，主要确认接受方和转移方测试的等效性，待转移的方法事先已经过验证并通过。转移的方式多种，转移的方式包括无转移行动、方法审核和比较性测试3种，见表1。

表1 分析方法验证、确认和转移比较

2 方法验证（Validation）

验证所需测定的项目为：专属性：精密度（包括重复性、中间精密度、重现性）；准确度；检测限和定量限；线性和范围；耐用性等项目，每个项目测定都有其目的以及接受的标准。

2.1 专属性

专属性主要看主成分、杂质、赋形剂等相互干扰情况。对HPLC法，可用保留时间（RT）或相对保留时间（RRT）、分离度来表示，对于主成分含量测定，主要考察主成分和其它杂质的分离情况，对于杂质测定除考察和主成分分离情况，还要考察杂质之间的分离情况（包括杂质是否能洗脱等）。

对于用于稳定性测试的方法验证，需要增加进行强降解实验来考察方法的专属性，通过苛刻的条件在较短的时间内加速降解，主要考察降解产物是否和主成分重叠，从而影响稳定性的考察，其次可以了解产品的降解途径和杂质产生情况，这和影响因素试验目的不同，所有的强降解试验都要测定峰纯度。

对于固体制剂一般只做固态下的强降解试验（如光照、高温、高湿），而对于液体制剂和原料药，液固状态下的试验一般都要进行（如酸、碱、氧化、光照、高温、高湿）。主成分一般降解到约75%，如果产品稳定，降解时，可最长放置10天，如果不稳定，可以少放置一些时间，可以预先试验，如果产品不溶于酸或碱性水溶液，可以先使用有机溶剂溶解，然后加入一定量的酸和碱溶液。

特别注意的是强降解试验目的主要是考察主成分峰和杂质纯度以及主成分和杂质降解途径，所以它不是一个定量测定项目，没有必要也无法取得各组分的物料平衡，其原因为各种条件降解的杂质结构非常复杂，很难取得每个降解杂质的对照品，测定的只能是和主成分相比的表观含量，很难得到样品中各降解杂质的真实含量，如需要了解所有杂质是否洗脱并检测，可以开发梯度和液质连用技术来考察，而不是使用物料平衡方法来解决这一问题。

2.2 精密度

精密度包括重复性、中间精密度、重现性。重复性和中间精密度是实验室内部精密度，而重现性用于实验室之间的精密度。

重复性的测定方法ICH推荐2种方法，在规定定量范围内，至少3个浓度和至少9次（独立样品或对照品）测试（3浓度80%、100%和120%，各3次），或者100%浓度至少6次（独立样品或对照品）。

中间精密度的测定也可与耐用性项目一起测试，主要是确定不同条件下测定的波动情况。通常情况下，选择2位分析师2个场合（一般2台仪器）分别分析独立制备的6个样品（12个结果进行评估）即可。

重现性的测试需要不同的实验室，企业难于做到，一般法规不作要求，根据实际条件中间精密度和重现性只选择测定其中一个，不必重复进行。

精密度的接受标准往往采用相对标准偏差（RSD）来考察，具体接受标准依据待分析样品的分析方法、质量标准分别规定。

2.3 准确度

准确度常常使用回收率来表示，对于主成分测定方法，由于测定是采用主成分的对照品来进行的，由于其结构一样，通常只做常规测试浓度下的80%、100%和120%的3个浓度，每个浓度进行3个独立样品测试，结果为9个数据进行回收率、相对标准偏差计算。对于杂质的测定方法则相对复杂，由于常规测试方法往往是杂质相对于主成分的含量（即表观含量），但杂质和主成分结构不同，导致响应不同（如紫外检测器的吸收系数不同），因此，较科学的做法是得到杂质对照品，在测定准确度的同时测定其响应因子，否则，回收率是无法符合接近于100%的要求。此外由于杂质的含量范围比较宽，一般低浓度取定量限 （或报告限，一般为0.05%），高浓度取质量标准规定值的1.5倍，在此浓度范围内进行5或6个独立样品的测定（由于杂质对照品很难获得，也可以使用贮备液进行稀释作为独立样品），当无法得到杂质对照品时，准确度的测定只能测定表观的准确度而非真实准确度，药政部门一般根据实际情况也予以接受。

准确度的接受标准往往采用回收率和RSD%来计算，具体接受标准依据不同质量要求，各公司的规定不尽相同，没有统一标准。

2.4 检测限和定量限

检测限和定量限的测定方法基本一致，只是计算的指标不同。有2种方法测定：一种为信噪比为3/1（对于检测限）和10/1（对于定量限）时的相对浓度或绝对量，这是优选的方法；另外一种是，根据响应值的标准差（空白的标准差）和斜率（线性范围曲线斜率）来计算：DL=3.3δ/S（检测限）和DL=10δ/S（定量限）。

检测限和定量限的接受标准通常有2个，其中最常用和最方便的方法为：对于检测限3个独立样品得3个数据都大于3倍噪音。对于定量限6个独立样品得6个数据都大于10倍噪音。检测限和定量限最后一定要通过一系列接近估计值的样品实际测定来验证，如和估计值不一致，采用测量值而不是估计值。

2.5 线性和范围

关于线性和范围的浓度范围，主成分测定方法和杂质测定方法不同，对于主成分测定，是常规测试浓度下的80%至120%（溶出度是规定范围的±20%，或50%至150%，含量均匀度是测定浓度的70%至130%）的范围内，5到6个样品浓度进行测定。而对于杂质测定，是定量限（或报告限，一般为0.05%）至标准规定值的1.5倍浓度范围内，5或6个样品浓度进行测定，为减少工作量，可以和准确度项目一起进行。

线性和范围得出的回归方程除考察相关系数至少大于0.99（但HPLC方法至少大于0.999）外，特别注意还需要考察其截距。国家食品药品监督管理局规定回归曲线Y轴截距应在100%响应值的25%以内[7]，其实这个要求很低。建议使用和测定中间浓度对照法，即测定的其他浓度点的响应和中间浓度（往往是实际测定浓度）点的响应进行计算，其所有值的相对标准差应不大于10%。只有在证明呈线性后，才能使用一个浓度的对照溶液进行日常的测定，如不符合规定，应对分析操作（如流动相的背景吸收，溶剂的选择等方面）进行调查或采用多点标准校正。

2.6 耐用性

任何系统（如仪器波长、流量、柱温、缓冲液的pH等）都存在误差，而所有测试又都要符合系统适用性参数要求（如柱效、分离度、拖尾因子、保留时间等），作为方法验证必须考虑到这些偏差因素。耐用性是指方法在参数有小的变化时，测定结果不受影响的承受程度。USP[8]对可以变化的参数范围作了具体规定,其可以变化的前提是基于耐用性试验结果，如按照其所规定的范围变化视为相同方法而不需要再验证。

耐用性一般包括：仪器方面如流量、检测波长、柱温、色谱柱；操作方面如缓冲液的pH、流动相的比例；样品方面如溶液稳定性；其考察指标为目标峰的系统适用性参数是否符合规定。但样品溶液稳定性是考察其含量不降低（一般规定降低不超过1%）。

3 方法确认（Verification）

方法确认的操作和验证相同，但进行的项目就要少得多，测定哪些项目与测定的方法本身有关，同时还与测定的目的有关，各个公司一般都制定具体的要求，需要说明的是：不是USP、EP所有项目都要确认，如pH、水分、重金属、灰分、比旋度、熔点等简单操作，不必进行确认，有些只要进行检测前仪器校正等工作。如果药典方法确认失败，先查找原因，如确是方法本身缺陷，可与药典部门联系，提出建议，比如修改或替代。

4 方法转移（Transfer）

方法转移往往伴随着企业的其他技术或产品转移的，WHO[8]有专门技术转移指南，USP[9]也专门对分析方法的转移提出要求。

5 讨 论

5.1 杂质分析和主成分分析验证的比较

杂质分析和主成分分析验证的项目、要求有很多差别，见表2。

表2 杂质分析和主成分分析验证比较

5.2 关于是否加入样品或空白处方问题

5.2.1 对于杂质测定方法验证 专属性、精密度、准确度（响应因子）、耐用性都应该加样品，以考察样品的存在对杂质测定的影响，而线性、检测限、定量限测定如果制备不到不含杂质的样品，建议不加样品进行测定，加样品反而导致更大的误差。

由于样品一般都含有杂质，所以在测试相关项目需加样品时，其样品杂质越低越好（最好没有），如含有，注意考虑样品本身杂质和加入的杂质浓度总和来进行验证方案的浓度设计，并在计算过程中扣去样品本底。

5.2.2 对于制剂主成分的测方法定验证 专属性、精密度、准确度、线性、耐用性都应该模拟配方。

5.2.3 对于原料药主成分测定方法验证 只有准确度项目需要加样。

5.3 杂质响应因子问题

杂质如按照常规检测相对于主成分的含量，其响应因子非常重要，一般测定的响应因子如在0.8～1.2之间[10]可以作为1，而响应因子小于0.2，大于5，则说明检测方法不适用，建议改用其他方法。

5.4 其他问题

分析方法和仪器的确认（Qualification）不同，不需要进行再验证，除非测定样品的工艺和配方产生变化，或方法本身发生改变才有必要进行再验证。此外，分析方法验证必须在仪器周期性确认（Qualification）有效期内进行。每个验证项目都必须在系统适应性参数测定符合规定后方可进行，如有必要应再校正。

[1] The Interna tionalConference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH).Q2(R1)Validation of Analytical Procedure:Text and Methodology[S].

[2] U.S.Pharmacopoeia 34.Validation of Compendial Procedures[S].2010:621,1225.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].附录 XIX A药品质量标准分析方法验证指导原则，2010.

[4] 国家食品药品监督管理局.药品生产质量管理规范[S].2010.

[5] European Commission.Good Manufacturing Practice Medicinal products for Human and Veterinary Use.Part II:Basic Requirements for Active Substances used as Starting Materials:12 Validation[S].2008.

[6] BeckerG.Inadequate validation ofanalyticalmethods remains permanene topic in warning letters to APImanufactures[EB/OL].http://www.gmp-compliance. org/eca_news_2930_7215,7186,7305,7182,7153_rss.html.

[7] 黄晓龙.有关物质分析方法验证的可接受标准简介[J].化学药物评价，2006-02-08.

[8] World Health Organization(WHO).Annex 7.WHO guidelines on transfer of technology in pharmaceutical manufacturing[S].

[9] U.S.Pharmacopoeia 35.Transfer of Analytical Procedures[M].1224.

[10] 谢沐风.如何建立高效液相色谱法测定有关物质的方法[J].中国医药工业杂志，2007，38（1），45-8.