针对Abl-T315I突变的Bcr-Abl蛋白激酶抑制剂的研究进展

李婉贞，薛晓文

中国药科大学 药物化学教研室，南京 210009

随着2001年美国FDA批准的第一个治疗慢性粒细胞白血病 （chronic myelocytic leukemia，CML）的 Bcr-Abl（Abelson proto-oncogene/breakpoint cluster region）酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼的出现，寻找小分子化合物抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶以治疗CML逐渐成为人们关注的热点。然而，随着临床应用的增加，部分患者对伊马替尼产生了耐药性。伊马替尼耐药性的产生主要与Bcr-Abl激酶的突变有关，目前已证实的Bcr-Abl突变有15种，包括Y253H、E255V、E255K、F359V、T315I等在内，其中以T315I在突变中占的比重最大，达20%的耐药程度，且耐药程度最高。T315I突变直接影响与伊马替尼的结合，而不显著影响与ATP的结合。该突变主要是由较大的疏水性的异亮氨酸 （Ile）替代了Abl激酶315位的苏氨酸（Thr）造成的，它消除了抑制剂与激酶高亲和力的结合所需要的氢键，并且在空间上阻碍伊马替尼与ATP结合位点的结合[1]。为克服伊马替尼的耐药问题，新的、更为强效的第二代TKI达沙替尼（Dasatinib）和尼罗替尼（Nilotinib）应运而生，这两种药物能克服大部分突变产生的耐药性，但仍不能有效抑制T315I突变。随后开发的一系列药物如伯舒替尼（Bosutinib）、巴菲替尼（Bafetinib）、塞卡替尼（Saracatinib）等也都对该突变束手无策[2]。更糟糕的是，如果患者反复使用达沙替尼和尼罗替尼等第二代TKI，T315I突变所占的比例会进一步增加。因此，开发针对T315I突变有效的TKI已迫在眉睫。本文拟就目前正在开发中的对T315I突变具有抑制活性的Bcr-Abl蛋白激酶抑制剂进行综述。

1 ATP竞争性抑制剂

1.1 VX-680（MK-0457）（1）

VX-680（MK-0457）是由默克公司（Merck）和维泰士公司（Vertex）共同研发的一种小分子极光激酶、JAK-2以及FLT3（fms-related tyrosine kinase 3）的多重抑制剂，能够阻断细胞周期而引起不同类型的肿瘤细胞的凋亡。令人欣喜的是，VX-680与Bcr-Abl活性部位连接后不仅能抑制野生型Bcr-Abl的活性，还具有抗T315I突变的活性[3]。这种抑制剂是目前报道的第一种对T315I突变有临床活性的激酶抑制剂，已经进入伊马替尼耐药性的CML和ph+ALL（费城染色体阳性的急性淋巴细胞白血病）的2期临床研究中。

VX-680对Abl-T315突变体的半数抑制浓度（IC50）为30 nmol·L-1。对其晶体结构进行研究，结果显示，VX-680与极光激酶A（Aurora-A）的铰链区结合后形成一个疏水口袋，这个疏水口袋能够与Bcr-Abl和伊马替尼耐受的突变株结合。这个模型也许能够解释VX-680能够同时抑制Aurora-A、Abl和Abl-T315I突变的原因[4]。

1期和2期临床研究表明，VX-680给药后，3例有伊马替尼耐药性和T315I突变的病人出现了血液学反应，并且没有显著的髓外毒性，其中两例病人的突变体克隆的浓度也下降了。当VX-680与达沙替尼联合用药时，能够降低T315I突变以及其他突变发生的概率，并且提高达沙替尼的治疗效果和持续时间[4]。

令人遗憾的是，在2期临床研究中，一位患者的心电图在给药后发生改变，这导致Vertex公司终止了该化合物的研发，但它新颖的分子结构设计策略却为针对T315I抑制剂的开发提供了有益的启示。

1.2 Ponatinib（2，AP24534）

Ponatinib是Ariad公司研发的口服多种激酶抑制剂，能够抑制Bcr-Abl、Flt3和Src激酶的活性。它对大多数Bcr-Abl突变株有抑制作用，包括T315I突变株，目前已进入2期临床研究阶段。其对野生型 Abl激酶和 Abl-T315I突变株的 IC50分别为0.37、2.0 nmol·L-1[5]。

与第二代Bcr-Abl激酶抑制剂不同的是，在体外诱变筛选实验中，Ponatinib没有引起新的突变。1期试验结果表明，在2年试验期中，Ponatinib的MCR率（主要细胞遗传学缓解率）都持久稳定。92%的有T315I突变的患者取得了显著细胞遗传学缓解率（MCyR），即费城染色体降至35%或更少。对于没有T315I突变的患者，MCyR率在一年期达到了61%。对于在先前接受了至少2种以上TKIs治疗后均以失败告终的Ph+CML患者，在服用Ponatinib 后有50%获得完全的血液学反应。重要的是，随着时间的推移，Ponatinib能够持久地缓解病情，并且提高缓解程度。对于有T315I突变的患者来说，这种药是一种突破。

1.3 达努塞替（3，Danusertib，PHA-739358）

达努塞替是由Nerviano Medical Sciences公司研发的1，4，5，6-四氢吡咯 [3，4-c]吡唑类似物，是Aurora激酶A和B的ATP-竞争性抑制剂[6]。最新研究发现它能够抑制Bcr-Abl激酶的活性，并且对T315I突变株也有效。

达努塞替在广泛的人Bcr-Abl阳性与阴性细胞中表现出很强的抗增殖与促凋亡的作用 （IC50=25 nmol·L-1），并且能抑制鼠Ba/F3细胞中异位表达野生型或伊马替尼耐药的Bcr-Abl突变，包括T315I（IC50为0.12 μmol·L-1）。它能够抑制产生Ph染色体的K562白血病细胞的活性，并且能够抑制位于Abl激酶的活性环区域的Tyr412的磷酸化作用。在白血病细胞株，包括对伊马替尼耐药的细胞株中发现伊马替尼与达努塞替具有药理学的协同作用[5]。目前，该药正在进行对伊马替尼耐受和具有Abl-T315I突变的CML患者的2期临床研究[18]。

1.4 BO1（4）

该化合物是在研究1,3,4-噻二唑类诱导药时，通过对数据库内药效团的分子对接及分子动力学模拟发现的。研究表明BO1在抑制Abl激酶活性表现出高度的潜力。在对于伊马替尼敏感的和耐受的白血病细胞中都显示出一定的生物活性 （LD50=2.2 μmol·L-1）[8]。它对Abl的抑制能力是Src的5倍。

体外实验表明，化合物BO1对T315I突变株表现出明显的抑制作用，它对T315I突变株的抑制能力是野生型Abl的4倍。

该类化合物以游离酶为靶标，在与游离酶形成酶-抑制剂复合物之后，ATP和肽都不能再与相应的酶相结合。对于Abl激酶的情况，其取代位置更为复杂，BO1同时以游离酶以及酶-肽复合物为靶点，阻止ATP的结合[9]。对于野生型Abl，它是个ATP竞争性抑制剂，但当作用于T315I突变株时，表现为非竞争性抑制剂。

2 非ATP竞争性抑制剂

2.1 ON-012380（5）

ON-012380是由Onconova Therapeutics研发的非ATP竞争型抑制剂，与伊马替尼不同，ON-012380阻断底物结合位点，而不是ATP结合位点。体外实验表明，ON-012380既能抑制野生型ABL激酶，也能抑制所有伊马替尼耐药突变的激酶。不仅如此，ON-012380还能抑制血小板衍生生长因子受体（PDGFR）激酶和Src家族的Lyn，但对干细胞因子受体（c-kit）的抑制作用很弱。目前该药还未进入临床试验阶段。

ON-012380能够特异性抑制Bcr-Abl，并且体外实验表明，在浓度小于10 nmol·L-1时即可引导表达T315I突变体的Ph+CML细胞的凋亡。它能够显著地抑制Bcr-Abl的自磷酸化和作为底物的调节蛋白Crk的磷酸化 （IC50=9 nmol·L-1），是伊马替尼的10倍以上（IC50=100 nmol·L-1），并且不管是在体内还是体外该化合物抑制T315I突变的活性是伊马替尼的10000倍，对T315I重组蛋白的IC50为1.38 nmol·L-1（伊玛替尼几乎无活性）[10]。当它与伊马替尼同时给药时，对抑制Bcr-Abl能够发生协同作用，说明两者与Bcr-Abl在不同的部位结合，这也进一步证实了ON-012380是个非ATP竞争型抑制剂。

体内实验表明，对裸鼠腹腔注射100 mg·kg-1，能够显著地抑制T315I白细胞的增长。啮齿类动物对ON-012380的耐受性良好，连续三周以上每天服用浓度超过100 mg·kg-1也没有引起血液中毒[10]。

2.2 GNF-2（6）

GNF-2是在寻找能够靶向性结合Abl激酶中除与ATP结合位点以外的其他部位，从而达到抑制Abl激酶活性的过程中发现的。它可以不直接抑制Abl激酶区域，却能高效选择性地抑制Abl和Bcr-Abl（IC50=0.14 μmol·L-1）转变细胞[11]，是非ATP竞争性抑制剂。最新研究表明，在Abl激酶域的C端存在一个肉豆蔻结合口袋，GNF-2通过与其结合使得非活性构象的Abl结构被夹住而处于稳定状态[12]。

在小鼠模型中，当GNF-2/GNF-5与ATP竞争性抑制剂同时作用于Bcr-Abl时，能够显著地减少突变发生的几率，并且能够同时抑制野生型和T315I突变的Bcr-Abl激酶活性[13]。

2.3 DCC-2036（7）

DCC-2036是由Deciphera Pharmaceuticals研发的，有望治疗那些对标准治疗发生抵抗且很少有其他治疗选择的白血病患者。研究发现，药物DCC-2036在小鼠模型中可抗击CML，且对人类白血病细胞有效。这些结果表明，DCC-2036是一种用于临床研发治疗CML的良好候选药。目前，DCC-2036正在那些应用两种其他TKIs无效的患者中进行1期临床试验[5]。

DCC-2036能有效抑制磷酸化和非磷酸化状态下的Abl活性（IC50=0.8 nmol·L-1），通过非ATP竞争机制，避免与Ile315位阻冲突，同时还能诱导Ba/F3细胞的凋亡。该细胞能表达多种与Bcr-AblTKI耐药相关的突变株，包括T315I，许多突变的P-环，达沙替尼耐药的突变F317L等。DCC-2036对Abl、FLT3、TIE2基因和Src家族激酶具有高度选择性，对Abl-T315I的IC50为4 nmol·L-1。在100 mg·kg-1· day-1灌胃给药时，显著延长患有由野生型Bcr-Abl和T315I逆转录病毒表达诱导慢性粒细胞白血病，如延长骨髓增生性疾病的小鼠的生存时间[6]。

由此可见，Bcr-Abl激酶的非ATP竞争性抑制剂也是个战略性的研究方向。

3 其 他

另有文献报道一些TKI，如Doramapimod（8，BIRB-796）[14]，Aurora A抑制剂 AT-9283（9）和SGX-70430[5，14]等也具有抑制T315I突变的活性，但这些化合物与Bcl-Abl激酶的作用机制还未见报道。其中SGX-70430的结构还未见文献报道。

Doramapimod（8）是德国勃林格殷格翰公司研发的一种新型肿瘤坏死因子-α（TNF-α）抑制剂，主要用于TNF-α水平升高所引发的一些炎性疾病的治疗。最新研究表明，Doramapimod能够抑制伊马替尼耐药的Abl-T315I突变。它与Abl-T315I结合紧密，其亲合常数Kd=40 nmol·L-1，但是与野生型Bcl-Abl和其他类型的伊马替尼耐药的突变株的结合力要弱得多，Kd＞1 μmol·L-1[15]。

AT-9283（9），是由Astex Therapeutics公司研发的一种Aurora抑制剂，有文献报道称其具有抑制野生型Bcl-Abl和T315I突变的活性，目前该药物正在进行针对固体瘤以及包括CML在内的血液病的1期临床研究中，其给药方式为每星期一次，连续静脉注射24小时[16]。

SGX-70430是由美国SGX医药品公司采用FASTTM法开发出的对野生型Bcl-Abl和4种常见突变（包括T315I）均有效的化合物。体外实验结果表明，其抑制Ba/F3突变细胞株T315I和M351T细胞增殖的半数有效浓度 （EC50）分别为21 nmol·L-1和15 nmol·L-1，明显低于伊马替尼。SGX-70430目前正在进行1期临床研究。

4 展 望

对伊马替尼耐药的Bcr-Abl突变体生物学结构的认知，使得Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂的研发进入了一个新的阶段。由于T315I突变能引起高水平（＞100倍）的伊马替尼抵抗，因而针对该突变研究新型有效的抑制剂将具有巨大的药理学意义。虽然目前还没有抗T315I突变的激酶抑制剂上市，但已有多个这样的抑制剂进入临床研究[2，17-18]。开发能抑制T315I突变的新颖高效Bcr-Abl抑制剂，并且在联合用药方面作进一步探索，将是治疗慢性粒细胞白血病的方向。

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