茵陈蒿汤HPLC指纹图谱初步研究*

杨爱华，窦志华，罗 琳，葛建华，孟 萍

1南京中医药大学，南京 210046；2南通大学附属南通第三医院，南通 226006；3南通大学，南通 226001；4南通市药品检验所，南通 226006

茵陈蒿汤出自汉代张仲景所著《伤寒论》，由茵陈、大黄、栀子组成，具有清热除湿、利胆退黄的功效，为中医治疗湿热黄疸的第一要方。现代研究结果表明，茵陈蒿汤不仅具有促进胆红素代谢的作用，还具有抗肝损伤、抑制肝细胞凋亡、抑制星状细胞活化等作用[1]，有着广阔的应用前景。多年来，茵陈蒿汤的药效物质基础研究一直是中医药现代化研究的热点之一，但是以往的研究过分强调单一成分的作用。众所周知，中药复方的作用特点是多成分、多靶点的整体调节。指纹图谱技术能较好地解决如何表征中药复方的整体性和复杂性，其包含的不同性质的各类化学成分可通过一张或多张指纹图谱得以表达。这些化学成分的整体情况，包括其所含的物质数、物质量和组成比例差异，都会对功效产生影响。专家指出，应该将中药指纹图谱中化学成分的变化与中药药效结果联系起来，建立中药“谱（组）效学”研究体系[2]。本实验对茵陈蒿汤指纹图谱进行初步研究，为下一步谱效关系分析奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100 Series高效液相色谱仪 （配四元泵、脱气装置、自动进样器、DAD紫外检测器），HP ChemSation工作站 （美国Agilent公司）；Milli-Q超纯水系统 （法国Millipore公司）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣）；BOLONG-USC502超声清洗器（上海波龙电子设备有限公司）；Sartorius BP211D型电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 试剂

乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merk公司）；其余试剂均为分析纯；水为自制重蒸馏水。

1.3 对照品与药品

没食子酸、绿原酸、栀子苷、大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚（均购自中国药品生物制品检定所，批号分别为：110831-200302、110753-200413、110749-200613、110756-200110、110796-200615、0757-200206、110795-200806、758-9904）；茵陈（产地陕西）购自江苏众益康医药有限公司，栀子（批号0802002）购自江西樟树天齐堂中药饮片有限公司，大黄购自甘肃礼县春天药业有限公司，经南通药品检验所龚旭东主任中药师鉴定，以上中药饮片的原植物来源分别为菊科滨蒿、茜草科栀子和蓼科掌叶大黄。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

图1 对照品（A）、大黄（B）、茵陈蒿汤（C）及茵陈+栀子（D）HPLC色谱图

2.1.1 茵陈蒿汤供试品溶液的制备 称取茵陈粗粉22.5 g、栀子粗粉15 g、大黄粗粉7.5 g，加纯化水煎煮3次 （14倍量30 min，10倍量30 min，7倍量20 min），合并水提液，过滤，旋转蒸发仪浓缩至约50 mL，加乙醇使含醇量为60%，4000 r·min-1离心10 min，上清液移置250 mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，取5.5 mL置25 mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，即得。进样前用孔径为0.45 μm的微孔滤膜滤过。

2.1.2 大黄供试品溶液的制备 取大黄粗粉7.5 g，按“2.1.1”方法制备大黄溶液。

2.1.3 茵陈+栀子供试品溶液的制备 取茵陈粗粉22.5 g、栀子粗粉15 g，按“2.1.1”方法制备茵陈+栀子溶液。

2.1.4 对照品溶液的制备 精密称取大黄素2.73 mg、大黄酚2.82 mg、大黄酸2.30 mg、芦荟大黄素3.13 mg、大黄素甲醚2.85 mg、没食子酸3.04 mg、绿原酸3.73 mg、栀子苷3.02 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2 色谱条件考察

2.2.1 流动相的选择 比较乙腈-0.1%磷酸和甲醇-1%醋酸作为流动相的分离效果，结果表明，同一条件下乙腈较甲醇对茵陈蒿汤的分离效果较佳。因此，选择乙腈-0.1%磷酸作为流动相。

2.2.2 检测波长的选择 吸取茵陈蒿汤供试品溶液10 μL进样测定，对254 nm、280 nm及440 nm波长下的色谱图进行分析比较。结果表明，在254 nm下出峰最丰富，其他波长下未见新成分色谱峰，因此选定254 nm为指纹图谱测定波长。

2.2.3 柱温的选择 同一条件下考察柱温对各峰的影响，结果以30℃为佳。

2.2.4 流动相的优化 吸取茵陈蒿汤供试品溶液10 μL进样，流速1.0 mL·min-1，比较乙腈（A）-0.1%磷酸（B）系统3种不同梯度变化程序，结果表明，（梯度程序为：0～5 min，5%A；5～10 min，5%～10%A；10～30 min，10%～15%A；30～50 min，15%～20%A；50～ 65 min，20%～25%A；65～75 min，25%～35%A；75～85 min，35%～50%A；85～95 min，50%～85%A；95～100 min，85%～90%A；100～110 min，90%A；110～115 min，90%～5%A；115～120 min，5%A）在254 nm波长下色谱峰分离情况较好。

2.2.5 运行时间的确定 考察了上述选定条件下120 min色谱图，发现105 min后无特征峰出现，故将分析时间定为110 min。

根据以上试验结果，最终确定以下色谱条件：welch-materials XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相：乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱 （程序见“2.2.4”）；柱温：30℃；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：254 nm；运行时间：110 min；进样量：10 μL。

2.3 部分共有峰鉴定及归属分析

分别取对照品溶液、大黄供试品溶液、茵陈蒿汤供试品溶液及茵陈+栀子供试品溶液各10 μL，按“2.2”项的考察选定的色谱条件分别进样测定。比较茵陈蒿汤、大黄及茵陈+栀子色谱图，对共有峰进行初步归属分析。见图1。

由图1可知：（1）初步建立的茵陈蒿汤指纹图谱有8个成分得到鉴定：没食子酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚来源于大黄；绿原酸和栀子苷来源于茵陈、栀子。（2）指纹图谱保留时间在40～50 min及70 min以后共有峰主要来源于大黄；保留时间在0～30 min及50～60 min共有峰主要来源于茵陈和栀子。而保留时间在60～70 min共有峰既来自大黄也来自茵陈和栀子。

3 讨 论

本次试验的茵陈蒿汤供试品溶液取自茵陈蒿汤制剂水煎原液的60%乙醇上清液部分，主要原因是因为药效试验结果表明，茵陈蒿汤保肝利胆作用的药效物质主要是存在于水煎原液的60%乙醇上清液部分，该上清液部分的指纹图谱，也为以后从谱效关系角度深入研究茵陈蒿汤药效物质基础奠定了基础。

本课题组前期研究建立了HPLC法测定茵陈蒿汤中绿原酸、栀子苷及5种蒽醌类成分的方法[3-4]，研究同时表明，茵陈蒿汤中大黄所含成分与其他两味药茵陈、栀子的色谱行为差异较大，故本试验将全方拆分成大黄及茵陈与栀子两部分制备供试品进样检测，从本次试验结果看，茵陈蒿汤所含化学成分可以通过一张指纹图谱来表达。

[1] 徐国萍，白 娟，舒静娜，等.茵陈蒿汤药理研究进展[J].浙江中西医结合杂志，2011，21（1）：64-7.

[2] 贺福元，邓凯文，罗杰英，等.中药谱效学研究方向初探[J].世界科学技术-中医药现代化，2004，6（6）：44-50.

[3] 葛建华，窦志华，罗 琳，等.HPLC法测定茵陈蒿汤中绿原酸和栀子苷的含量 [J].江苏中医药，2009，41（1）：56-7.

[4] 葛建华，窦志华，罗 琳，等.高效液相色谱法测定茵陈蒿汤中5种蒽醌类成分的含量 [J].中国医院药学杂志，2009，29（7）：590-2.