甜茶中鞣花酸抗过敏性实验研究

薛茗月，罗星晔，湛志华，陈全斌

（1.桂林师范高等专科学校化学与工程技术系，广西桂林541001；2.桂林环保局，广西桂林541003；3.广西师范大学资源与环境学院，广西桂林541004）

甜茶（Rubus Suavissmus S.Lee，Sweet Tea），是蔷薇科悬钩子属植物的一个品种、广西的特产[1]。主产于广西的柳州、桂林、梧州等地区，甜茶具有祛痰止咳、清热、润肺等功效，广泛用于保健品、食品和化妆品等领域中[2]。有关研究表明，鞣花酸具有多种生物活性功能，例如抗氧化功能、抗癌[3]、抗突变性能[4]、能抑制人体免疫缺陷病毒（HIV）的增生[5]；鞣花酸还是一种有效的凝血剂[6]，对多种细菌、病毒都有很好的抑制作用，能防止感染抑制溃疡[7]。除此之外，鞣花酸还具有降压、镇静，预防骨质疏松等多种生理作用[8]。鞣花酸作为一种新型的药物原料和食品添加剂日益受到人们的重视。李小萍[9]，贝玉祥[10]，周本宏[11]、王予祺等[12]分别对对红树莓果、诃子、石榴皮和蛇莓中的鞣花酸含量进行了测定，其中诃子中鞣花酸含量最高，达到了573 mg/kg；李小萍等[13]研究了红树莓果重鞣花酸的抗氧化性研究，发现莓果中的鞣花酸提取物具有较强的还原能力。因此，开展甜茶中鞣花酸的研究，对甜茶植株的化学成分分布、开发甜茶系列产品、甜茶的推广应用具有重大意义。近年来，甜茶的研究越来越受到重视，但重点均局限于对甜茶素[14]、黄酮苷[1]及其苷元[14]的提取和测定，甜茶粗体物药理[15]的研究，而对甜茶中鞣花酸的研究鲜见报道。因此，本文对甜茶中鞣花酸进行抗过敏的研究，为开发以甜茶为原料的保健品、天然抗过敏性药物提供理论参考。

1 材料与仪器

1.1 试剂

甲醇（CP）、蒸馏水、无水Na2SO4、石油醚（AR）、氯仿（CP）、乙酸乙酯（CP）、95%工业酒精、无水Na2SO4。

扑尔敏（批号：070504），广东南国药业有限公司产品；磷酸组织胺（批号：0609015）：中科院上海生化所东风生化技术公司产品；医用天花粉：市售。4%（g/g）氢氧化铝凝胶（批号：060308）：广西南宁制药企业集团公司产品；鞣花酸标准品：Sigma-Aldrich 公司；LSA-10大孔吸附树脂：西安蓝深交换吸附材料有限责任公司。

1.2 仪器

722 型光栅分光光度计：上海分析仪器三厂产品；中试型智能控制连续化多功能超声波提取组GDCTQ/ZS/3：济宁金百特电子有限责任公司制造。

1.3 动物

昆明种小鼠，体重18 g～22 g，雌雄各半，清洁级（合格证号：SCXK 桂2003-0003）：广西医科大学实验动物中心提供。小鼠分性别饲养于空调实验室内，室温：（22±2）℃，相对湿度：（60±2）%，喂颗粒标准饲料，自由饮水和摄食。

1.4 数据统计方法

实验所得数据采用PEMS3.1 统计软件进行分析，各试验组与对照组之间采用t 检验进行比较。

1.5 鞣花酸的制备

取甜茶根2 kg，碾碎后置入40 L 超声波提取罐，加20 L 水，加热至80 ℃，超声提取1 h，膜过滤，重复一次，合并滤液，浓缩，滤液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，萃取液用无水Na2SO4脱水，再用旋转蒸发仪回收部分溶剂，放置，乙酸乙酯萃取液得到黄色颗粒结晶，碱溶酸沉，经水洗、醇洗后，红外干燥仪中干燥，得黄色颗粒结晶化合物A（约2.0 g）。

2 鞣花酸的鉴定

采用KBr 压片法，在波数为4 000 cm-1～400 cm-1范围分别对鞣花酸对照品（标准样品）和样品A 进行扫描，其谱图见图1。

鞣花酸标样的主要吸收峰[IR（KBr）/cm-1]：3 555，1 698，1 621，1 582，1 511，1 448，1 390，1 335，1 259，1195，1115，1059，922，882，758。其中3555cm-1为O-H伸缩振动频率，1 698 cm-1为C=O 的伸缩振动频率，1 621，1 582，1 511，1 448 是苯的C=C 伸缩振动峰。

样品A 的主要吸收峰[IR（KBr）/ cm-1]：3 559，1 695，1 618，1 582，1 511，1 451，1 395，1 346，1 257，1 195，1 111，1 056，922，882，757。样品A 与鞣花酸对照品的红外谱图谱峰的重合性较好，各峰波数基本一致，并与文献[13]相符。因此，制备得到的黄色颗粒结晶物A 为鞣花酸。

3 鞣花酸抗过敏对比试验

3.1 对小鼠被动皮肤过敏试验[16]

抗原：医用天花粉。佐剂：4%氢氧化铝凝胶。临用时用0.01 g 天花粉溶于4 mL 氢氧化铝凝胶中。致敏，健康小鼠10 只，体重18 g～22 g，将上述天花粉氢氧化铝凝胶混悬液脚掌注射，两只后脚掌各注入0.05mL，共注射0.1 mL。15 d 后，断头取血，离心取抗血清备用。

被动皮肤过敏：另取小鼠60 只，体重18 g～22 g，雌雄各半。随机分为正常对照组，扑尔敏（4 mg/kg）组，鞣花酸大小剂量（200、100 mg/kg）组，每组10只。每天灌胃给药1 次，正常对照组给予等体积蒸馏水，连续给予5 d。取上述血清（10 只致敏小鼠的混合抗血清）加生理盐水稀释成1 ∶5，每只鼠腹壁皮内注射两个点（相距0.2 cm），每点0.03 mL。并再连续给药2 d，于末次给药12 h 后，每只小鼠进行抗原攻击，尾静脉注射天花粉（2.5 mg/mL，用1%伊文思蓝-生理盐水配制）0.2 mL/只，20 min 后处死动物，剪下腹部蓝斑皮肤（0.5 g），剪碎，浸泡于丙酮生理盐水溶液（7 ∶3）5 mL 中48 h，离心（3 000 r/min）15 min 取上清液，用分光光度计于610 nm波长处测定吸收度（OD），并作组间比较，评价药物的抗过敏作用，结果见表1。

表1 鞣花酸对小鼠被动皮肤过敏反应的影响Table 1 The effect of ellagic acid and crude extracts of Rubus Suavissimus S.Leeon the passive skin allergy of mice

结果表明，鞣花酸样品和阳性药扑尔敏能显著抑制小鼠被动皮肤通透性，减少腹部蓝斑皮肤浸出液的光密度值，提示鞣花酸样品具有很强的抗皮肤过敏作用，强弱对比顺序如下：鞣花酸样品＞扑尔敏。

3.2 对组胺致小鼠毛细血管通透性增高的作用[17]

取小鼠60 只，雌雄各半，随机分为正常对照组，扑尔敏（4 mg/kg）组，鞣花酸大小剂量（200、100 mg/kg）组，每组10 只。每天灌胃给药1 次，正常对照组给予等体积蒸馏水，连续给予5 d。于末次给药30 min 后，腹部皮内注射组胺10 μg/mL，形成一小皮丘，立即尾静脉注射0.5%伊文思蓝0.0l mL/g，30 min 后处死动物，用直径0.8 cm 的打孔器打下两片蓝染皮片，放入3 mL生理盐水-丙酮（3 ∶7）混合液中，在37 ℃恒温水浴锅中放置24 h，浸出液离心，取上清液，用721 型分光光度计（610 nm）测吸光度，结果见表2。

表2 鞣花酸对组胺致小鼠毛细血管通透性增高的影响Table 2 The effect of ellagic acid and crude extracts of Rubus Suavissimus S.Lee on mice which induced increase of capillary permeability by histamine

结果表明，鞣花酸大小剂量组均能明显减少大鼠蓝斑皮肤的光密度值，显示抑制组胺致小鼠毛细血管通透性增高，提示鞣花酸对组织胺引起的皮肤毛细血管通透性的过敏反应具有很强的抑制作用。

3.3 对二硝基氯苯所致迟发型皮肤过敏反应的影响[18]

取小鼠60 只，雌雄各半。随机分为正常对照组，扑尔敏（4 mg/kg）组，鞣花酸大小剂量（200、100 mg/kg）组，每组10 只。各组小鼠腹部用电推剪去毛（3×3 cm），用1%2，4-二硝基氯苯（DNCB）丙酮液50 μL 涂于小鼠腹腔皮肤致敏，致敏前一天灌胃给药，连续9 d，致敏后7 d 以1%DNCB 涂右耳攻击，24 h 后脱颈椎处死，剪取左右耳相同部位，用直径为8 mm 的打孔器打下圆耳片称重，以两耳片重量差值（肿胀度）为指标，评价药物的抗过敏反应。结果见表3。

表3 鞣花酸对二硝基氯苯所致迟发型皮肤过敏反应的影响（x±s）Table 6 The effect of ellagic acid and crude extracts of Rubus Suavissimus S.Lee on the skin allergy which caused by the impact of dinitrochlorobenzene delayed

结果表明，鞣花酸大小剂量组均能明显减少二硝基氯苯致敏小鼠耳朵重量，减少肿胀度，提示其对二硝基氯苯所致迟发型皮肤过敏具有很强的抑制作用。

3.4 磷酸组织胺引起的豚鼠致痒反应模型的影响[18-19]

取60 只豚鼠，体重350 g～500 g，雌雄各半，随机分为正常对照组，阳性药扑尔敏（4 mg/kg）组，鞣花酸大小剂量（200、100 mg/kg）组，每组10 只。于实验前1 h 剪去右后腿部毛并用砂纸擦伤皮肤，面积约2 cm2。各组给药或生理盐水30 min 后，用0.05%磷酸组织胺50 μL，涂抹擦伤皮肤，3 min 内豚鼠如不出现舔擦伤皮肤动作，再涂抹一次组织胺，如此重复操作，直至出现为止，记录涂抹组织胺次数及累积用量，结果见表4。

表4 鞣花酸对组织胺所致豚鼠皮肤致痒的影响（x±s）Table 4 The effect of ellagic acid and crude extracts of Rubus Suavissimus S.Lee on the itch skin of guinea pig which caused by histamine

结果表明，鞣花酸大小剂量组均能明显增加涂抹豚鼠组织胺次数及累积用量，提示其具有明显抑制磷酸组织胺引起的豚鼠致痒作用。

4 结果与讨论

研究表明，被动皮肤过敏是由Ig E 类抗体所介导而引起的I 型变态反应性病症，其临床常见疾病有过敏性休克、支气管哮喘、过敏性鼻炎、荨麻疹等。小鼠同种被动皮肤过敏试验，是小鼠致敏后用同种抗原攻击，可引起肥大细胞脱颗粒，释放过敏介质（组织胺、慢反应物质、5-羟色胺等），使皮肤局部血管的通透性增加，在抗原攻击的同时加入伊文思蓝染料，根据局部皮肤染料渗出的多少，判断血管通透性的变化，为筛选抗过敏作用药物的有效方法。皮内注射过敏介质（如组织胺），使皮肤局部血管的通透性增加，同时静脉给予伊文思蓝，用比色法测定，根据染料的通透量反映毛细血管通透性大小，可直接反应出药物是否有拮抗过敏介质的作用。

鞣花酸能显著降低被动皮肤过敏小鼠皮肤蓝斑的光密度值；以及能明显拮抗过敏介质组织胺所致的小鼠毛细血管通透性增加；明显抑制二硝基氯苯所致迟发型皮肤过敏反应；抑制磷酸组织胺引起的豚鼠致痒反应。综上所述，鞣花酸在多种致敏动物模型实验中证实，具有显著的抗过敏作用，为鞣花酸进一步的研究与开发提供了实验参考。

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