秦川牛血红素提取工艺的研究

马志科，昝林森，马 丽

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100）

秦川牛血红素提取工艺的研究

马志科，昝林森＊，马 丽

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100）

以秦川牛血为原料提取血红素，选择影响提取的主要因素——氯仿加入量、酸性丙酮加入量、p H分别作为单因素进行梯度试验，确定其合适范围，进一步通过正交试验选取最佳提取条件。结果表明，提取血红素的最佳工艺为氯仿加入量为血溶体积的5倍，酸性丙酮加入量为血球蛋白滤液的5倍，调节p H4～5。

秦川牛；血红素；提取工艺

血红素（heme）是血红蛋白组成不可缺少的组分，它是由原卟啉IX与Fe2＋结合而成，与珠蛋白结合成血红蛋白。它在体内主要的生理功能是载氧，帮助呼出CO2，除在血红蛋白、肌红蛋白中担负O2和CO2运输外，还是细胞色素P450、细胞色素C、过氧化物酶的辅基。临床上它可作为有机铁补血药［1］、抗贫血药［2］，临床上均有显著疗效。它也是制备抗癌特效药——血卟啉衍生物的原料［3］。在食品工业上可用于食品强化剂，食用色素等［4］。提取血红素的方法较多，不同的方法各有其特点，影响的因素也较多。本文参考相关资料［5－9］，对秦川肉牛血红素提取工艺进行研究，旨在完善提取血红素的方法，为综合开发牛血资源提供依据。

1 材料与方法

1．1 材料

秦川肉牛血采自杨凌某屠宰场；血红素标准品为Sigma公司产品；柠檬酸三钠，氯仿，NaCl，HCl，NaOH，丙酮等均为分析纯。酸度计（PHS－3C）为上海精密科学仪器有限公司产品；电子分析天平（BS210S）为北京赛多利斯天平有限公司产品；离心机（LD4－2）为北京医用离心机厂产品；真空干燥箱（DZF－3）为上海福玛实验设备有限公司产品；紫外可见光度计（UV1100）为上海美谱达仪器公司产品。

1．2 方法

1．2．1 工艺流程 新鲜抗凝牛血→离心→红细胞→洗涤→溶血→加氯仿→分离血红蛋白→过滤去纤维→加酸性丙酮溶液搅拌→抽提得血红素溶解液→氢氧化钠沉淀→HCl调p H→沉淀→干燥得血红素。其中，抗凝剂为柠檬酸三钠，每升新鲜牛血加25 g。离心条件为3 000 r／min，15 min。洗涤用9 g／L的NaCl溶液。溶血用加等体积红细胞的去离子水。

1．2．2 氯仿加入量对提取血红素的影响 试验设置氯仿加入量分别为血溶体积的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍，分离血球蛋白滤液。以血红素提取量（g／L）为指标，选择氯仿加入量的适宜范围。

1．2．3 酸性丙酮加入量对提取血红素的影响 酸性丙酮为含丙酮30 m L／L的盐酸，试验设置酸性丙酮加入量分别为血球蛋白滤液的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍，抽提血红素。以血红素提取量（g／L）为指标，选择酸性丙酮加入量的适宜范围。

1．2．4 p H对提取血红素的影响 提取血红素滤液用NaOH处理后，用1 mol／L HCl分别调p H为6．0、5．0、4．0和3．0。以血红素提取量（g／L）为指标，选择适宜p H范围。

1．2．5 正交试验 根据单因素试验选择的适宜范围，通过L9（33）正交试验确定最佳提取条件。

1．2．6 血红素含量测定 根据文献［10］绘制标准曲线，在OD385 nm下测定样品含量。

2 结果与分析

2．1 氯仿加入量对提取血红素的影响

红细胞溶血后，加入氯仿分离血球蛋白滤液，氯仿加入量对提取血红素的影响结果见图1。由图1可知，氯仿加入量在2倍～5倍范围内，随加入量增加时，血红素含量快速增加。超过5倍继续增加时，血红素含量缓慢增加。

2．2 酸性丙酮加入量对提取血红素的影响

血红蛋白溶液用酸性丙酮溶液浸提，酸性丙酮加入量对提取血红素的影响结果见图2。由图2可知，酸性丙酮加入量由2倍增至3倍，血红素含量缓慢增加。加入量在3倍～5倍时，血红素含量快速增加，超过5倍继续增加时，血红素含量缓慢增加。

图1 氯仿加入量对提取血红素的影响Fig．1 The effect of added chloroform volume on heme extraction

图2 酸性丙酮加入量对提取血红素的影响Fig．2 The effect of added acid acetone volume on heme extraction

2．3 p H对提取血红素的影响

提取血红素滤液用NaOH处理后，用1 mol／L HCl调节不同p H，p H对提取血红素的影响结果见图3。由图3可知，p H从6～4，血红素含量迅速增加，p H从4～3，血红素含量迅速下降，说明p H对提取血红素影响较大。

2．4 正交试验

在单因素试验的基础上，选用L9（33）正交表，设置三水平，氯仿加入量为血溶体积的4倍、5倍、6倍；酸性丙酮加入量为血红蛋白滤液体积的4倍、5倍、6倍；p H 选择为4．0、5．0、6．0。进行正交试验，以血红素提取量（g／L）为指标，优化提取血红素的工艺参数，结果见表1。

图3 p H对提取血红素的影响Fig．3 The effect of p H on heme extraction

表1 正交试验结果Table 1 Orthogonal trial results

从表1可以看出，三个因素对提取血红素含量都有影响。极差R最大的因素是p H，其次是酸性丙酮加入量和氯仿加入量，即对提取血红素含量影响程度大小顺序为p H＞酸性丙酮加入量＞氯仿加入量。从正交试验结果看，最优组合为A3B2C1，即氯仿加入量为血溶体积6倍，酸性丙酮加入量为血球蛋白滤液5倍，p H为4．0。由于氯仿加入量影响程度最小，加入量过大给后续处理带来困难，也浪费试剂增加成本，综合考虑5倍适宜。从而得出最佳组合条件为，氯仿加入量为血溶体积5倍，酸性丙酮加入量为血球蛋白滤液5倍，p H4～5。

3 讨论

3．1 分离血红蛋白

新鲜牛血中含有大量凝血因子和凝血酶原。在钙离子存在时，凝血因子和凝血酶原被激活而发生作用使血液凝固，影响血细胞分离。因此，新鲜牛血加入柠檬酸钠，能使钙离子沉淀而得到抗凝全血。经离心分离得到血细胞，血细胞膜破裂或溶解后，就可分离出血红蛋白。血细胞与适量水混合后，降低了细胞外渗透压，使血细胞吸水导致细胞膜胀裂，同时配以适量的机械作用，如搅拌或超声波等，可以提高破裂速度［11］。由于细胞膜中含有脂蛋白，故凡能使脂类溶解或改变脂类物理性状的物质如氯仿、乙醚等，都能引起膜的脂双层破坏而溶血。本试验加入一定量氯仿，使血细胞膜破裂和溶解同时进行，血红蛋白从血细胞中较完全地分离出来。

3．2 提取血红素

血红蛋白是由4分子亚铁血红素和1分子珠蛋白结合而成。根据血红素与珠蛋白的结合在p H＜3．0时最为疏松，极易被有机溶剂提取出来的原理。本试验采用含30 m L／L盐酸的丙酮溶液提取血红素，丙酮使蛋白质凝固沉淀，同时血红素呈溶液状态进入丙酮相。用抽滤的方法使固液两相分离，对液相进一步处理得到血红素。考虑有机溶剂状态下，p H不易测定，为使提取液p H保持在3．0左右，加入5倍30 m L／L盐酸的丙酮溶液。

3．3 综合利用

提取血红素用血细胞为材料，血浆可以做水解蛋白之用，还可以加工制备成血浆蛋白粉。血浆蛋白粉在仔猪料中使用效果良好，尤其在早期断奶仔猪中使用，效果更是得到广泛认可［12］。牛血提取血红素后剩余的部分变性蛋白可用做饲料添加剂，还可以进一步水解得到氨基酸、多肽和蛋白胨等。

［1］ 翁聪颖，柳启沛，徐达道．高铁食用酵母铁资源生物利用率评价［J］．营养学报，1990，12（2）：172－176．

［2］ 于茂泉，宫爱君．复方氯化血红素纠正贫血的疗效观察［J］．上海预防医学杂志，2004，16（9）：424－425．

［3］ 王丹侠，崔世勇．血红素的应用分析研究进展［J］．上海预防医学杂志，2002，14（5）：219－220．

［4］ 朱 钧，沈建英，杨廷超．血红素的提取及补血食品的研制［J］．营养学报，1993，15（1）：69－72．

［5］ HU W，Link H，Lang W．Preparations purification and characterization of chlorohaemin［J］．Biol Chem Hoppe Seyler，1992，373（6）：305．

［6］ 张 恒，王新华，龚飞琴．鸡血中血红素的提取［J］．中国家禽，1998，20（4）：8－9．

［7］ 李秀玲，余 蓉，杨继虞，等．高纯度血红素制备工艺的改进［J］．四川大学学报：医学版，2004，35（5）：738－744．

［8］ 葛 慧，云 霞，曹 方，等．鸵鸟血中血红素的提取研究［J］．食品研究与开发，2006，27（9）：49－51．

［9］ 钟耀广．利用冰醋酸提取血红素的研究［J］．食品科学，2004，25（4）：90－95．

［10］ 袁 曦，黄晓梅．紫外光谱法测定强力铁胶囊中氯化血红素含量［J］．现代应用药学，1996，13（1）：36－37．

［11］ 刘 树，石飞云，杨大庆．超声波对血细胞破壁作用的研究［J］．食品科技，2005（1）：13－15．

［12］ 詹黎明，吴 德．血浆蛋白粉的作用机制及其在猪生产中的应用［J］．中国饲料，2009（13）：13－17．

Study on Technology of Extracting Heme from Qinchuan Cattle Blood

MA Zhi－ke，ZAN Lin－sen，MA Li

（CollegeofAnimalScienceandTechnology，NorthwestA＆FUniversity，Yangling，Shaanxi，712100，China）

Heme extracted from Qinchuan cattle blood was studied．The main factors，namely chloroform added，acid acetone added，p H were chosen to carry on the gradient test，as single factor respectively，to make the range of each single factor．The orthogonal trial of L9（33）was used to select the suitabl combination conditions of extraction．The results showed that the optimum condition for the extraction of heme were：chloroform and blood volume at a ration of 5∶1（V∶V），acid acetone and hemoglobin solution at a ration of 5∶1（V∶V）and p H 4－5．

Qinchuan cattle；heme；extraction technology

Q586

A

1007－5038（2012）06－0084－03

2012－03－01

农业部公益性行业科研专项（nyhyzx07－035）资助

马志科（1960－），男，陕西武功人，硕士，高级实验师，主要从事教学实验及科研工作。＊通讯作者