CD47在急性髓细胞白血病干细胞中的表达及其临床意义探讨

李婉红 陈葆国 郑 瑞 李伯利

研究表明，白血病干细胞(leukemia stem cells，LSCs)是白血病发生、发展的起始细胞，少量的LSCs具有无限增殖和自我更新能力，能逃逸化学药物治疗作用，从而导致白血病复发［1～3］。近年来，随着对LSCs细胞生物学特性的深入研究，CD123、CD96、CD44等一些在急性髓细胞白血病(AML)LSCs过表达的分子陆续被发现，为临床上靶向治疗白血病提供了重要依据。新近，又有文献报道，AML LSCs高表达CD47，提示其是潜在的单克隆抗体治疗靶点，而目前国内罕见相关报道［1，3～5］。为系统地了解CD47在AML中的生物学特性，我们应用多参数流式细胞术分析其在AML LSCs中的表达规律，结合临床探讨其意义。

对象与方法

1.对象:(1)AML患者:自2009年3月～2011年10月笔者医院确诊的147例(除外急性早幼粒细胞白血病)AML患者，患者年龄12～78岁，中位年龄43岁，其中男性80例，女性67例。按FAB标准分别为:M0 8例、M1 21例、M2 43例、M4 30例、M5 35例、M6 10例。初诊骨髓原始细胞32% ～99%。化疗方案:DA、HA等。所有患者均签署知情同意书。(2)健康对照者:19名健康对照者包括9名骨髓移植供者，10名体检者，其中男性13名，女性6名，年龄22～47岁，中位年龄32岁。

2.方法:(1)仪器与试剂:流式细胞仪FACSCaliburTM为美国BD公司产品。小鼠 IgG1－(PE、FITC、Percp或APC)、CD34－APC、CD38－Percp、CD123－PE、CD90－FITC、CD33－FITC、P170－FITC、CD117－FITC、CD13－FITC、CD15－FITC、 CD11b－FITC、CD64－FITC、CD14－FITC、CD20－FITC、CD22－FITC、CD3－FITC、CD7－FITC、CD5－FITC、CD2－FITC购自美国BD公司。CD47－FITC购自美国eBioscience公司。(2)标本采集:化疗前采骨髓2～5m l肝素钠抗凝，常规分离单个核细胞(MNC)，用磷酸盐缓冲液制成细胞浓度为1×107/ m l的单细胞悬液备用。(3)单克隆抗体标记及流式分析:正常对照和病例样本用CD34－APC/CD38－Percp散点图设CD34+CD38－细胞门，然后再分析 CD47、CD123、CD117、CD90、P170、CD33、CD13、CD11b、CD15、CD64、CD14、CD20、CD22、CD7、CD3、CD5、CD2等抗原表达。用流式细胞仪和Cell Quest软件获取并分析30000～400000个骨髓单个核细胞。结果:CD47用平均荧光强度(MFI)和百分率表示，以≥20.00%为阳性。P170用百分率表示，以≥10.00%为阳性。其余抗原用百分率表示，以≥20.00%为阳性。(4)随访:对131例AML患者进行跟踪随访，统计复发、死亡病例，记录生存时间。

3.统计学方法:应用SPSS 13.0软件包进行分析。计数资料用χ2检验分析，计量资料呈偏态分布，用［中位数M(P2.5～P97.5)］表示，进行秩和检验。用直线相关进行相关性分析。AML患者总生存率比较采用Kaplan－Meier生存分析和Logrank检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.CD47在健康对照者骨髓造血干细胞中的表达:19名健康对照者骨髓原始细胞 Lin－CD34+CD38－(HSC)亚群中CD47的表达百分率为15.42% (6.63% ～20.23%)，其中 CD47阳性仅 4例(21.05%)，结果显示HSC CD47表达阳性率很低。

2.CD47在AML患者原始细胞中的表达:147例 AML患者骨髓原始细胞Lin－CD34+CD38－(LSCs)亚群中CD47阳性112例，占76.19%，与健康对照组HSC细胞比较差异有统计学意义(χ2=24.30，P＜0.01)。根据 FAB分型，8例 M0中 7例阳性(87.50%)，21例M1中16例阳性(76.19%)，43例M2中33例阳性(76.74%)，30例M4中21例阳性(70.00%)，35例M5中27例阳性(77.14%)，10例M6中9例阳性(90.00%)。CD47在AML各亚型LSCs的阳性率差异无统计学意义(χ2=2.08，P＞0.05)(表1)。CD47在LSCs表达百分率和MFI均高于CD34+CD38+亚群(U值分别为4.90、3.03，P均﹤0.01)，也远高于正常造血干细胞中的表达水平(U值分别为4.76、6.24，P均﹤0.01)(表2、图1)。表明CD47在LSCs的表达量明显增多。

表1 CD47在AM L亚型LSCs中的表达情况

表2 CD47在健康对照和AM L患者中不同细胞亚群上的表达情况

3.CD47和P170在AML LSCs中表达的相关性:147例AML患者骨髓LSCs CD47的表达率与多药耐药蛋白P170的表达率呈显著正相关(r=0.83，P＜0.01)。

4.CD47在AML LSCs中的表达与临床特征的关系:CD47与AML患者性别、年龄、原始细胞数量无关(P均 ＞0.05)。AML患者有肝、脾、淋巴结大者CD47阳性率高于无肝、脾、淋巴结大者，差异有统计学意义(χ2=15.77，P＜0.01)。外周血白细胞≥20.0 ×109/L AML患者 CD47的阳性率 ＜20.0×109/L AML患者，差异有统计学意义(χ2=5.07，P＜0.05) (表3)。提示，CD47过表达的AML患者易髓外浸润。

图1 CD47在AM L LSCs中的表达

表3 CD47在AM L LSCs中的表达与临床特征的关系

5.CD47在AML LSCs中的表达与预后的关系: 147例AML患者中，除外16例因放弃治疗或转外院治疗失访，共计131例入组进行为期1～31个月的随访。根据CD47在AML LSCs中表达的阳性和阴性分为两组:CD47阳性的AML患者99例，CD47阴性的AML患者32例。99例CD47阳性的AML患者中有46例复发占46.46%，32例CD47阴性的AML患者中有8例复发占25.00%，两者比较差异有统计学意义(χ2=4.60，P＜0.05)。随访31个月后，99例CD47阳性的AML患者中共43例死亡，占43.43%，32例 CD47阴性的 AML患者中共 6例死亡，占18.75%，两者比较差异有统计学意义(χ2=6.29，P＜0.05);生存分析显示，CD47阳性的AML患者平均生存时间18.99±1.15个月，低于CD47阴性的AML患者平均生时间24.90±1.87个月差异有统计学意义(P＜0.05)。表明CD47过表达的AML预后差，生存时间短。

图2 AM L患者LSCs CD47表达的生存分析

讨论

CD47又称整联蛋白相关蛋白，是一种广泛表达的细胞膜表面的免疫球蛋白样蛋白质，是由特定的整联蛋白、G蛋白及胆固醇组成的超分子复合物［6］。与其配体信号调节蛋白(SIRPa)结合可产生抑制性信号，下调巨噬细胞的吞噬活性，进而对免疫系统产生抑制作用［7，8］。正常造血干细胞表面CD47的少量表达有助于维护机体内免疫系统的相对稳定，而AML患者的LSCs表面由于CD47的过量表达能够抵御自身被巨噬细胞吞噬，从而极大地降低了机体固有免疫系统对LSCs的清除［9］。

Jaiswal等［5］报道，AML及CML急变期LSCs的CD47表达水平较正常的HSC明显增加，而其他的骨髓增殖性疾病的骨髓干/祖细胞的CD47表达都未见增加。我们的结果显示，147例AML患者LSCs亚群中CD47阳性112例，占76.19%，明显高于健康对照组HSC CD47的阳性率。进一步分析AML患者原始细胞，发现CD47在LSCs的表达量显著高于CD34+CD38+亚群，与文献报道相符。本组AML患者LSCs CD47的阳性率与FAB分型亚型无关，与耐药蛋白P170则显著相关。Majeti等［10］研究也显示LSCs表面的CD 47表达水平通常与AML患者的FAB或M ICM分型无关，有t(8;21)(q22;q22)等临床预后较好的核型异常的患者CD47低表达，而有FLT3－ITD突变及1/3正常核型的AML患者中CD47却高表达。上述结果提示CD47的高表达可能与耐药、预后相关。此外，通过临床特征分析，我们还发现，CD47与AML患者性别、年龄、原始细胞数量无关，与肝、脾、淋巴结大及外周血高白细胞有关。提示，LSCs CD47过表达的AML患者易髓外浸润。

Majeti等［10］报道，成人AML患者经8年随访后发现，LSCs表面高表达CD47的患者无事件中位生存时间是6.8个月，总中位生存时间9.1个月，CD47低表达的患者无事件中位生存时间是17.1个月，总中位生存时间22.1个月，显示CD47低表达患者的生存时间比高表达的患者明显延长。本研究组131例AML患者随访31个月，结果显示，99例 LSCs CD47阳性的AML患者复发率(46.46%)和病死率(43.43%)高于 32例 CD47阴性患者的复发率(25.00%)和病死率(18.75%)。总生存时间分析显示，CD47阳性的 AML患者平均生存时间18.99± 1.15个月，低于CD47阴性的AML患者平均生时间24.90±1.87个月 差异有统计学意义(P＜0.01)。进一步证实LSCs CD47阳性的AML患者易复发，生存时间缩短、预后差。

总之，AML患者LSCs表面CD47普遍过表达，造成临床上治疗反应差，易复发、耐药、生存时间短、预后差。然而，CD47在LSCs细胞中的高表达也为单克隆抗体靶向治疗AML提供了依据，目前相关体外研究及动物实验已取得重要进展。

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2 Van Rhenen A，Moshaver B，Kelder A，et al.Aberrantmarker expression patterns on the CD34+CD38－stem cell compartment in acutemyeloid leukemia allows to distinguish themalignant from the normal stem cell compartment both at diagnosis and in remission［J］.Leukemia，2007，21(8):1700－1707

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4 J in L，Hope KJ，ZhaiQ，etal.Targeting of CD44 eradicates human acutemyeloid leukemic stem cells［J］.Nat Med，2006，12(10): 1167－1174

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8 Barclay AN，Brown MH.The SIRP family of receptors and immune regulation［J］.Nat Rev Immunol，2006，6(6):457－464

9 Cumano A，Godin I.Ontogeny of the hematopoietic system［J］.Annu Rev Immunol，2007，25:745－785

10 Majeti R，Chao M P，A lizadeh AA，et al.CD47 is an adversep rognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemiastem cells［J］.Cell，2009，138(2):286－299