HCV不同标志物检测结果比较分析

李 华 龙润乡 杨 蓉 蒋蕊鞠 董承红 易红昆 白慧珠 谢忠平

丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染引起的重要的世界性传染病之一，在中国人群的感染率达3.2%，其中50%～85%感染者发展为慢性丙型肝炎，10%～30%发展为肝硬化，肝硬化患者中约3% ～10%可演变为肝细胞癌［1］。HCV初发感染往往比较隐匿，仅有约20%～30%的感染者呈急性肝炎表现，所以选择快速、灵敏、特异的检测方法检出HCV十分重要［2，3］。本研究应用HCV核心抗原试剂盒、HCV游离抗原试剂盒、丙型肝炎病毒(HCV)抗体检测试剂盒(ELISA)及HCV核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒，对1551份血清或血浆临床样品检测丙型肝炎病毒不同的标志物，现将结果报道如下。

材料与方法

1.材料:(1)血清或血浆标本来源:云南省第一人民医院、昆明医学院第一附属人民医院及云南省血液中心3个单位的血清或血浆样品。(2)丙型肝炎病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂:深圳匹基生物工程有限公司生产，批号20080702。(3)丙型肝炎病毒核心抗原诊断试剂盒(酶联免疫法):国内某公司上市产品，批号20091101。(4)丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒(ELISA):上海科华生物工程有限公司生产，批号200908011。(5)丙型肝炎病毒游离抗原检测试剂盒(ELISA):中国医学科学院医学生物学研究所生产。

2.方法:(1)丙型肝炎病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测:采用丙型肝炎病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂，按试剂盒说明书进行荧光定量检测。(2)丙型肝炎病毒核心抗原检测:按试剂盒说明书进行ELISA检测HCV－Ag。(3)丙型肝炎病毒抗体检测:按试剂盒说明书进行 ELISA检测HCV－Ab。(4)丙型肝炎病毒游离抗原检测:包被HCV多表位复合抗原的多克隆抗体酶标板，先加入样品缓冲液50μl，待检样品50μl，37℃孵育2h，洗板5次后，加酶结合物100微升/孔，37℃孵育1h。洗板5次后，加TMB显色液，室温显色15min，于450nm波长检测OD值。

结果

1.HCV不同标志物检测结果分析:在1551份血清或血浆样品中，共检出HCV－Ab阳性样品565份、HCV－Ag阳性样品48份、HCV－RNA阳性样品317份、HCV－CAg阳性25样品。其中，HCV－Ab阳性样品(阳性率36.43%)检出率高于HCV－Ag阳性样品(阳性率3.09%，χ2=543.422，P=0.000)、HCVCAg阳性样品(阳性率1.61%，χ2=610.320，P= 0.000)及HCV－RNA阳性样品(阳性率20.445%，χ2=97.437，P=0.000)，2种试剂检出率皆显示差异有统计学意义;HCV－Ag阳性样品检出率(3.09%)高于HCV－CAg阳性样品(1.61%)，2种试剂检出率显示差异有统计学意义(χ2=7.421，P=0.006); HCV－RNA阳性样品(20.44%)检出率高于HCVAg阳性样品(3.09%)，2种试剂盒检出率显示差异有统计学意义(χ2=224.687，P=0.000);HCV－RNA阳性样品(20.44%)检出率高于HCV－CAg阳性样品(1.61%)，2种试剂检出率显示差异有统计学意义(χ2=280.203，P=0.000，表1)。

2.HCV－Ab指标相关性检测结果分析:在565份HCV－Ab阳性样品中，检出48份HCV－Ag(游离抗原)阳性样品，检出率为8.50%;检出23份HCV核心抗原(HCV－CAg)阳性样品，检出率为4.07%;检出317份HCV－RNA阳性样品，检出率为56.11%。在984份全阴性样品中，检出2份HCV核心抗原(HCVCAg)阳性样品，检出率为0.20%;但未检出HCV抗原及HCV－RNA(表2)。以上结果说明:HCV－RNA、HCV－Ag及HCV－CAg在HCV－Ab阳性样品中的检出率明显高于HCV－Ab阴性样品，具有明显的关联性。

表2 HCV抗原检测试剂盒临床研究不同性质样品结果分析

3.两种HCV抗原检测试剂检测结果分析:在317份HCV－Ab及HCV－RNA双阳性的样品中，HCV抗原检测试剂检出34份HCV游离抗原阳性样品(阳性率10.73%)，HCV核心抗原检测试剂检出23份HCV核心抗原阳性样品(阳性率7.26%)，HCV抗原检测试剂检出率高于HCV核心抗原检测试剂，但2种试剂检出率显示差异无统计学意义(χ2= 2.333，P=0.1267)。

在248份HCV－Ab阳性、但HCV－RNA阴性的样品中，HCV抗原检测试剂检出14份HCV游离抗原阳性样品(阳性率5.65%)，HCV核心抗原检测试剂未检出阳性样品(阳性率0)，2种试剂检出率有明显差异(χ2=14.407，P=0.0001)。

在984份HCV－Ab及HCV－RNA双阴性的样品中，HCV抗原检测试剂未检出阳性样品(阳性率0)，HCV核心抗原检测试剂检出2份HCV核心抗原阳性样品(阳性率0.20%)，2种试剂检出率无明显差异(校正χ2=0.501，P=0.479，表3)。

表3 2种HCV抗原检测试剂对不同样品检测结果分析

4.HCV－Ab与HCV－RNA检测结果关联性分析:将本次所有样品HCV－RNA(荧光定量PCR)与 HCV－Ab(ELISA)检测结果进行分析，若以HCVRNA结果为金标准，则与用于HCV－Ab(ELISA)检测结果一致性84.01%、灵敏度100.00%、特异度79.90%、阳性预测值 56.11%、阴性预测值100.00%。HCV－Ab(ELISA)检出率(36.43%)明显高于核酸检出率(20.44%)。二者之间差异经配对t检验有显著性(χ2=248.0，P=0.0000);对两种检测结果进行关联度分析，两种检测结果明显相关，其r =0.6696(χ2=691.9，P=0.0000)。若以HCV－Ab结果为金标准，则与HCV－RNA(荧光定量PCR)检测结果一致性、灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值分别为84.01%、56.11%、100.00%、100.00%及79.90%。此结果提示，由于检测原理及检测的病毒标志物不同，荧光定量PCR与ELISA法检测结果之间存在一定的差异，并不能完全吻合而取代，也许更重要的是相互补充(表4)。

表4 HCV－Ab与HCV－RNA检测结果分析

讨论

HCV感染的实验室检查是丙型肝炎诊断的重要依据，所以检测方法的选择非常重要。HCV感染通常是持续性的终生感染，抗体检测是一个非常有效的方法，但由于存在“窗口期”及“静默感染”，此期检测不到相应的抗体，所以仍然有输血后丙肝的发生［4～6］。国外资料报道ELISA法检测HCV核心抗原比检测HCV抗体缩短窗口期平均58.2天，仅比RT－PCR检测HCV－RNA多0.24～3.33天，而抗体出现则比检测到HCV－RNA晚28～140天［7］。反转录多聚酶链反应(RT－PCR)是一个很敏感的方法。HCV －RNA可以在暴露后的1～2周被检出［8］。另外，在一些HCV感染后恢复期的人群中，抗HCV可能会逐渐降低到检测限之下，或免疫功能低下的HCV感染者，抗HCV会持续阴性，这时，HCV－RNA的检测是感染的唯一证据［9］。故使用RT－PCR技术检测HCV－RNA是判断感染最有效的方法。但其技术复杂、条件要求较高，不易在多数实验室推广。HCV抗原(HCV－Ag)包括核心抗原(HCV－CAg)、NS5、NS3及NS4等，是HCV感染者体内出现的早期感染标志，其消长趋势与HCV－RNA有明显的一致性，具有早期诊断的重要价值［7］。HCV－Ag或HCV－CAg的检测有助于评价HCV在细胞中的表达情况。ELISA法较PCR法简便、快速，其方法简单、影响因素少、重复性好。因此，在不具备RNA检测条件的实验室开展HCV－CAg检测或HCV－Ag检测是很好的筛查方法。

本研究在1551份血清或血浆样品中，共检出HCV－Ab阳性样品565份(阳性率为36.43%)、HCV－RNA阳性样品317份(阳性率为20.445%)，2种试剂检出率显示差异有统计学意义(χ2=97.437，P =0.000)。HCV－RNA较HCV－Ab检出率低，原因是由于本实验采集的样品部分为特殊样品，且在HCV的3种标志物中，RNA不稳定，而核酸的稳定性较抗体差，导致在进行RT－PCR检测时，样品的检出率降低［10，11］。

在317份HCV－Ab和HCV－RNA双阳性样品及984份HCV－Ab和HCV－RNA双阴性样品，HCV－Ag及HCV－CAg 2种标志物检测结果检出率差异皆无统计学意义，由此说明HCV－Ag检测与HCVCAg检测结果有高度的相关性。但在565份HCVAb阳性样品中检出48份 HCV－Ag(检出率为8.50%)，23份HCV－CAg(检出率为4.07%)，2种试剂检出率有明显差异(χ2=9.393，P=0.0022);在248份HCV－Ab阳性、但HCV－RNA阴性的样品中，未检测出HCV－CAg阳性样品，而HCV抗原检测试剂检出14份，阳性率达5.65%，2种试剂检出率有明显差异(P=0.000)。可能是因为HCV－Ag检测试剂所使用的抗体为HCV多表位复合抗原的多克隆抗体，除C表位外，尚有NS3、NS5等多个表位，相对于HCV核心抗原的单克隆而言，捕获能力强、检测灵敏度提高。

综合比较分析，HCV的抗原、抗体及核酸标志物之间是相互关联的，任何单一标志物的检测均存在漏检风险，HCV－CAg试剂与HCV－Ag试剂可作为HCV－Ab检测的补充试剂，可联合应用于临床检测及血源筛选，但其灵敏度有待提高［12］。

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9 Alter HJ，Seeff LB.Recovery，persistence，and sequelae in hepatitis C virus infection:a perspective on long－term outcome［J］.Semin Liver Dis，2000，20(1):17－35

10 龙润乡，李华，崔萍芳，等.丙型肝炎病毒3种标志物的稳定性［J］.中国生物制品学杂志，2009，22(5):468－469

11 刘长利，任芙蓉，吕秋霜，等.不同处理和保存条件下体外HCV RNA稳定性研究［J］.中国实验血液学杂志，2006，14(6):1238－1243

12 刘杰平，张贺平.丙肝病毒核心抗原与丙肝病毒抗体检测的相关性［J］.海南医学，2008，19(10):152－153