鸡传染性贫血病毒实验室检测方法研究进展

庄金秋，梅建国，沈志强

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州256600；2.吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春130062）

鸡传染性贫血（chicken infectious anemia，CIA）是由鸡传染性贫血病毒（chicken anemia virus，CAV）引发，自1979年日本学者Yuasa等［1］分离到了鸡传染性贫血病毒以来，英国、德国、澳大利亚、美国等世界许多国家相继证明了该病毒的存在，我国亦于1992年由崔现兰等［2］分离到CAV。CAV在1995年的第6次国际病毒分类委员会维也纳会议报告中被归为圆环病毒科（circoviridae），环状病毒属［3］。游离CAV为DNA病毒，球形，直径约23～25nm，无囊膜，二十面体对称，是目前已知的最小病毒之一。CIA以引起雏鸡再生障碍性贫血和免疫抑制为主要特征，严重影响雏鸡生长发育和免疫反应，是危害养禽业的重要病原之一。该病对雏鸡和肉鸡威胁很大，造成的直接和间接经济损失相当可观，而且它还可与其他免疫抑制性传染因子（包括马立克病、传染性腔上囊病等免疫抑制性疾病病毒）相互作用，所造成的损失往往更大。CAV在鸡群中广泛存在，成鸡感染CAV后呈亚临床带毒状态，易被忽视，是养鸡业上潜藏的巨大威胁。因此对本病的防制越来越引起国内外兽医工作者和养禽界的高度重视，并被列为禽病研究的前沿课题。对CAV的检测国内外报道较多，本文对该病毒的实验室诊断方法研究进展作一简要概述。

1 病毒分离鉴定

肌肉注射或腹腔内接种1日龄SPF雏鸡是初次分离CAV最特异、可靠的动物试验方法。试验证明1日龄雏鸡接种感染CAV后7d病毒滴度达最高，其中胸腺内病毒含量高于肝脏和骨髓，因此在所有的病鸡组织中，以胸腺作为病毒分离材料最好，其办法是在鸡发病后7d采取胸腺，以Eagle液制成20%乳剂，反复冻融3次，加等量氯仿混合或70℃感作5min，去掉或灭活可能的污染物，2 500 r／min离心10min后，取上清液作为病毒分离材料。接种14～16d后对感染雏鸡做贫血症状检查，发现红细胞比容（HCT）低于27%，剖检可见特征性骨髓黄化、胸腺萎缩、肌肉皮下出血及其他贫血症状，可初步诊断为CIA阳性。有些HCT值不是很低的鸡也可出现典型的肉眼可见病变，也将其判为CIA阳性。

体外分离病毒，目前普遍使用MDCC－MSBl传代细胞做体外培养。接种细胞的初始浓度为（2～3）×105个／mL，接种剂量一般为1∶10体积分数，感染的细胞每隔2～4d继代1次。经过1～6次带毒继代，可见感染细胞肿胀、边缘破裂，死亡细胞逐渐增多，直至最后CAV感染细胞大部分死亡，培养液颜色不再发生改变，细胞不能继续传代。细胞不能再继续传代者判为分离阳性，一般规定传7代，以决定材料中有无CAV存在［4］。

2 血清学诊断

2.1 病毒中和试验（NT） 中和试验既可用鸡，又可用培养细胞进行，该法敏感性很高，但需要3～4周方能完成。用雏鸡作中和试验时，用1日龄SPF鸡进行，将血清5倍稀释后在56℃灭活30min，与等体积量2×103CID50（可使50%雏鸡发病的有效剂量）的CAV混合后37℃作用1h或4℃过夜，接种5只1日龄SPF易感染鸡，每只0.3mL，接种后观察16d，有3只接种鸡发病判为抗体阳性，2只或1只接种鸡发病判为疑似，全部发病判为血清抗体阴性。以培养细胞作中和试验时，用经MDCC－MS－Bl细胞增殖的CAV为种毒，滴度约为106TCID50／0.1mL。将灭活的待检血清作1∶5稀释，再进行2倍倍比稀释，与等量含200TCID50／0.1mL的CAV培养液混合，把混合液放入37℃作用1h或4℃过夜，取0.1mL混合液接种1mL MSBl细胞培养物中滴定。每个稀释度至少要接种2孔（管）。感染细胞以1∶5继代，需经过7次，根据继代细胞是否死亡做出判定。血清抗体中和效价以稀释倍数的倒数表示。

2.2 免疫荧光试验（FA） 荧光抗体试验既可检测CAV抗原，又可检测抗体，均用CAV感染MDCCMSBl细胞进行。该方法符合率极高，使用较多。具体方法是在开始出现细胞溶解之前收集以CAV感染的MDCC－MSBl细胞，这个时间通常在接种后36～42h，收集的细胞涂片于载玻片上，风干后用丙酮固定后用作抗原。感染的细胞首先与适当稀释的待检血清反应，然后用荧光素标记的抗鸡IgG哺乳动物抗血清作用，用荧光显微镜观察结果，当镜检细胞核内有大小不等的黄绿色荧光染色颗粒，就可以认为待检血清中有抗体。胡清海等（2001）［5］研究建立的间接免疫荧光抗体（IIFA）方法，一方面可以监测鸡群的CAV抗体，进行流行病学调查及筛选试验用的阴性鸡群，另一方面可检测CAV基因工程亚单位免疫后鸡体内的CAV抗体水平变化。在检测鸡血清中低浓度的CAV抗体方面，间接FA试验的敏感性不如NT试验。

2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA） 目前已经建立了各种ELISA法用于检测和定量鸡血清中CAV抗体。王英等（2005）［6］用大肠杆菌表达的CAV部分VP1蛋白作为包被抗原，建立了CIA间接ELISA诊断方法，确定了抗原最适包被浓度为5 μg／mL，血清最适稀释度为1∶100，其作用时间为60min，酶标抗体最适作用时间为60min，S／P≥0.24为阳性，S／P≤0.19为阴性，介于二者之间为可疑的判定标准。该抗原不与鸡其他疾病的10种阳性血清反应，具有良好的特异性；批内重复试验，变异系数小于10%，批间重复试验，变异系数小于15%，具有良好的重复性；该方法可检出人工接毒后20d的血清抗体，直到试验结束110d时，仍能检出鸡血清阳性率为81%与全病毒包被抗原ELISA方法的检测结果符合率达92%以上，与进口诊断试剂盒的符合率为97%，为免疫鸡群抗体检测和进行CIA流行病学调查提供了一种快速简便的血清学诊断方法。

2.4 免疫胶体金技术 免疫胶体金快速诊断技术是20世纪80年代在免疫胶体金标记技术基础上建立起来的一种新型独特的诊断技术。孙素玲（2008）［7］对15周龄SPF鸡进行4次免疫后，制备CIA血清抗体并对其进行纯化，测定CAV抗原最佳包被浓度和血清的最佳稀释度，研究纯化后血清抗体的蛋白含量和效价。该研究为制备CIA胶体金快速诊断试纸条奠定了基础。

3 分子生物学诊断

3.1 聚合酶链反应（PCR）检测 2000年宋秀龙等［8］首次在国内建立了CAV的套式PCR检测方法，该方法具有高度的特异性和敏感性，已成功应用于临床试验。徐福洲等（2004）［9］应用PCR和斑点杂交检测试验感染雏鸡体内CAV的动态分布，两种检测方法均显示免疫器官是CAV的主要靶器官、胸腺和脾脏在各种组织中检出率最高，是临床检测中的首选样品。邓显文等（2009）［10］根据CAV的VP1、VP2基因序列的结构特点，设计合成了一对引物，建立了检测鉴别CAV的PCR技术，并研制出CAV－PCR检测试剂盒。该试剂盒具有特异、敏感、快速和准确的特点，适合在临床生产中推广使用。宋修庆等（2009）［11］根据CAV的基因序列，选取一段高度保守的基因序列作为目的片段设计引物与探针，将该目的片段克隆到pMD18－T载体中，作为阳性标准品。通过优化荧光定量PCR反应条件，建立了CAV的荧光定量PCR检测方法。结果表明，该检测方法的敏感性达到10个病毒拷贝／μL，与其他禽病病毒无交叉反应，批间与批内重复试验相关系数都小于5%。试验数据证明，该检测方法敏感性高，特异性好，重复性佳。张太翔等（2009）［12］建立了Taq man实时荧光定量PCR方法检测CAV，该方法灵敏度高，特异性好，可以进行定量分析，在禽病的快速检测上具有重要意义。

3.2 核酸探针检测法 Allan 等（1993）［13］利用PCR制备的生物素化DNA探针作原位杂交，可以检测福尔马林、石蜡包埋的胸腺切片中的CAV。刘岳龙等（1996）［14］报道的核酸探针检测法可从临床病料中检测CAV，用于大批田间样品作CAV带毒检测和流行病学调查。吉荣等（2001）［15］用digoxigenin标记的CAV和禽网状内皮增生症病毒（REV）核酸探针以及PCR技术对某种鸡场进行检测。姜世金等（2003）［16］用斑点杂交法同时检测鸡群中的CAV、鸡马立克氏病病毒（MDV）和REV。颜赟等（2010）［17］应用特异性核酸探针技术对来自山东省肉种鸡群采集102份有肿瘤病变的病、死鸡肝脏样品进行了检测，结果显示，MDV、REV、CAV的检出率分别为88.24%、79.41%、47.06%，且存在严重的共感染现象。孟斌等（2010）［18］采用地高辛标记的核酸探针－斑点杂交法对淘汰的商品肉鸡、病死商品肉鸡及淘汰肉种鸡进行了 MDV、CAV、REV和禽呼肠孤病毒（ARV）4种病毒病原的检测。

3.3 竞争性聚合酶链反应定量检测法 日本学者山口成夫等（2000）［19］用缺失一段核苷酸序列的CAV DNA通过PCR扩增，分子克隆，构建成了竞争性模板，然后将竞争性模板DNA、样品DNA和PCR反应试剂一起加入到反应管中进行PCR扩增，通过比较扩增产物量即可得出样品DNA含量，从而检测出样品中的CAV含量。这种方法不但特异性强，而且敏感性高，较传统的血清中和反应作定量检测大大节约时间和成本，因此该方法常用于分析病毒的定量和病毒在体内的分布等。刘泽文等（2005）［20］将删除33个碱基序列的CAV DNA 克隆进质粒pSBII，提取质粒DNA，经过纯化、定量后作为竞争性模板，建立了一种定量检测CAV核酸方法。该方法能够检测出的最低CAV DNA为103.5Molecules／μL，其精确度可达到100.5Molecules／μL。该方法与传统方法相比，具有节省时间、节约试剂和受其他因素干扰小等特点。

4 结论

CAV是一种特殊的病毒，具备一些常见动物病毒所没有的特性，可以发展成为一个研究动物病毒与宿主之间相互关系的理想模型，尤其是非编码区的特征性调控元件，如重复序列和淋巴组织特异的转录因子值得深入研究。目前国际上有两种商品化活疫苗可供免疫：一种是通过鸡胚增殖的有毒力CAV活疫苗和MSB1细胞中增殖的外源性病原活病毒。此类活病毒苗必须在开产前5周以上使用，以免垂直传播。第二种是通过长期细胞培养传代致弱的CAV弱化毒接种母鸡。尽管这两种疫苗免疫鸡后可产生良好的保护作用，但是都有亚临床症状产生，许多国家或地区不允许使用。在国内尚未研制出理想的疫苗用于预防鸡传染性贫血，对其防制仍采取一般性综合防制措施。因此，迫切需要研究可以准确、快速、简便、经济地检测CAV病原的诊断方法和高效的疫苗。病毒分离、血清学方法、PCR及核酸探针等技术的成功应用于CAV检测，开辟了CAV检测技术的新途径，随着新技术的不断发展，相信会有更多、更好的CAV检测新方法出现。

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