肺炎链球菌蛋白疫苗候选蛋白研究进展

李莉莉 郑 凡 王 健 (北京生物制品研究所，北京100024)

肺炎链球菌能够引起肺炎、脑膜炎、中耳炎等疾病，在世界范围内具有很高的致病率和致死率。患者主要集中在婴幼儿、老年人和免疫力低下的人群。据统计，每年大约有一百万的五岁以下儿童死于肺炎链球菌引起的疾病［1］。抗生素是肺炎链球菌引起疾病最常用的治疗药物，但是，耐青霉素和多重耐药菌的出现使这些疾病的治疗难度大大增加，同时，治疗费用也逐步攀升［2］，而疫苗是解决这个问题的最好方法。

荚膜多糖是最早被认识的肺炎链球菌致病因子，拥有80种以上血清型。1983年，美国批准使用23价肺炎链球菌多糖疫苗(23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine，PPV23)，该多糖疫苗对相对应的血清型(如1、2、3、4、5、6B、7N、8、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F)预防效果大于65%，但对此23个型别以外的其他型别的有效率为0%～60%。而携带和发病率最高的小于2岁的儿童和免疫受损害者对该疫苗的抗体应答较弱甚至无效［3］。7价结合肺炎链球菌疫苗(Heptavalent pneumococcal conjugate vaccine，PCV7)于2000年在美国上市，该疫苗是针对肺炎链球菌7个血清型(4，6B，9V，14，18C，19 F，23 F)的荚膜多糖，能够100%的预防其所包含的7个血清型细菌的感染。与23价苗的不同是，7价结合苗能够引起T细胞免疫，能够对小于2岁的婴幼儿有100%的作用，对于预防疫苗型菌株引起的侵袭性疾病有效率为97．4%。但因为仅包括7个血清型，该疫苗的应用在美国致使非疫苗型细菌所致侵袭性疾病的发病率升高了25%［4］。目前，国内13价结合苗也在研制中，但是这种结合苗质量难于控制，成本也大大增加。由于过于昂贵，所以一些经济欠发达地区的结合苗被放弃使用。这就要求研发更加有效且便宜的疫苗，而蛋白疫苗就是解决这个问题的最好途径。蛋白疫苗有以下几点优势:(1)保护作用范围广，可以对所有年龄和免疫状态的人群产生保护作用，并且诱发免疫记忆，保护力持久。(2)采用高度保守的共同蛋白作为疫苗，不受血清型限制，对于所有血清型均产生效果。(3)价格相对低廉，生产成本低，适合发展中国家大规模的使用。本文对最有希望成为候选疫苗的蛋白进行综述。

1 溶血素(Pneumolysin，Ply)

Ply是一个由471个氨基酸组成的分子量为53 kD蛋白，定位于肺炎链球菌的细胞浆，在细胞生长到某个阶段时被释放出来。Ply的主要作用是溶血和激活补体。Ply可能存在四个结构域，分别为domain1-4，其主要活性位点存在于domain4。Ply与受体结合并插入到细胞膜，启动溶血功能(主要定位在domain4 C末端)。而激活补体的区域主要定位于domain4 N末端［5］。Ply能够破坏蜂窝状连接细胞，阻止呼吸上皮和室管膜的纤毛蠕动;降低多型核白细胞的迁移和吞噬活性，能刺激宿主细胞释放炎性细胞因子［6］。通过与IgG的Fc段结合可直接激活补体的经典途径，同时促进炎症反应和消除血清的调理作用。

鼻腔和腹膜腔的肺炎链球菌攻击实验结果显示，重组Ply可使老鼠寿命延长89%和93%。在肺炎链球菌动脉注射的攻击实验中，Ply不能彻底保护老鼠。鼻内洗涤法也不能减低鼻内致病菌的数量。但是鼻内攻击实验中能够降低肺内的致病菌数。这些结果显示，Ply对于细菌在鼻咽的复制没有作用，但是对于病菌在肺部的复制、并且穿越肺部进入血液，最后在血液中高滴度复制具有重要作用［7］。

Ply的全氨基酸序列高度保守，抗原性强。因此，Ply可以作为覆盖所有血清型抗原疫苗的备选蛋白［8］，而且该疫苗潜能已经被不同实验室证实。尽管免疫制备方法不同、所用肺炎链球菌的血清型不同、实验动物种类不同，但是，Ply的保护作用实验得到了一致的结果。

2 肺炎链球菌表面粘附素A(Pneumococcal surgace antigen，PsaA)

PsaA是一个35 kD、由309个氨基酸组成的蛋白质［9］。PsaA在肺炎链球菌粘附、自溶以及毒力方面都起着重要作用。PsaA与多种菌体粘附素的氨基酸序列高度同源。X晶体衍射实验显示，PsaA是一个椭圆形蛋白［10］，模体分析结果确认，PsaA是一种脂蛋白，它的N末端共价结合在细胞膜的磷脂层上。因为细胞壁的厚度和蛋白大小的关系，PsaA被埋在多聚糖和荚膜多糖下面，所以，抗PsaA抗体无法结合到细胞壁上［11］。

PsaA在各个血清型中都是高度保守，没有大的抗原和分子变化。PsaA已经被作为疫苗在患有鼻炎、肺炎、菌血症和败血症的动物模型中进行了评价。多个实验室结果显示，PsaA免疫效果在鼻咽部分的作用效果明显，但在不同血清型之间存在差异，如对于WU2型，PsaA有良好保护性，但对A66．1作用就不明显［12］。PsaA对所有D39(3血清型)攻击的小鼠都能延长寿命，但对WCH43(4血清型)没有作用，推测可能在不同型别菌体的细胞壁厚度、荚膜多糖等因素决定了PsaA暴露程度不同，从而导致免疫效果有差异，所以，PsaA可以作为肺炎链球菌蛋白疫苗的重要组成部分。

3 肺炎链球菌表面蛋白A(Pneumococcal surfaceprotein A，PspA)

PspA是肺炎链球菌细胞表面的胆碱结合蛋白，也是一种重要致病因子。它的主要作用是与乳铁蛋白结合使乳铁蛋白丧失功能，从而失去乳铁蛋白对菌体生长的控制［13］;抑制补体活化，降低C3b在肺炎链球菌表面的沉积，从而干扰补体介导的吞噬调理作用［14］。PspA与PsaA和PLY不同的是，在不同型别间，PspA核酸和氨基酸序列并不保守。抗体免疫可以发生交叉反应，但并不是对每个血清型都有效。这种变化与菌体上荚膜多糖的血清型并不相关。尽管不同PspA的序列不同，但都有相似的空间结构。PspA有四个独立结构域:N末端的α螺旋、脯氨酸富集区、高度保守的20个氨基酸重复序列和在C末端轻度疏水的17个氨基酸序列［15］。根据细胞表面α螺旋区的不同，将PspA分成6个分支3个家族。家族1和2的α螺旋区有54%同源性，其他区域有84% ～100%同源性。研究显示，在美国、哥伦比亚、巴西、阿根廷大概有94% ～99%都是1和2家族。

在皮下和腹膜攻击的败血症动物模型中，全长PspA1蛋白使实验动物存活时间和存活率分别增加了80．6%和62．5%。用PspA氮末端α螺旋区免疫以皮下攻击的实验动物，可以延长动物的存活时间，对于同一家族的作用达50%，不同家族的作用为25%。保护作用的效力随使用的片段的长度的增加而加强。与PsaA和PLY相比，PspA在鼻内定植、肺炎、败血症有更广泛的保护作用。但是，PspA对胆碱有强烈干扰，而胆碱是细胞结构中重要的信号，而且这种干扰作用对于人或者实验动物的负面作用还没有得到验证。

4 胆碱结合蛋白A(Choline binding protein A，CbpA)

CbpA是一个多型蛋白，分子量在69 kD到120 kD之间，具有与PspA高度同源的胆碱结合结构域。CbpA的基因突变会导致肺炎链球菌与上皮细胞结合能力降低，也能导致在实验动物鼻咽部定植能力降低。提示CbpA有可能是主要负责肺炎链球菌与真核生物细胞粘附的作用［16］。CbpA还可以和补体C3以及人血清因子H结合。H因子是补体激活旁路途径的调节因子，可与C3结合加快C3降解。所以，CbpA能够帮助细菌免于补体旁路途径的攻击［17］。由此可见，CbpA是一个多功能蛋白，在肺炎链球菌粘附、入侵和逃避机体补体系统进攻过程中起主要作用。

CbpA序列主要有三个结构域，包括位于N端的多形态α螺旋区、保守的脯氨酸富集区、细胞壁锚定区。尽管CbpA在肺炎链球菌中有很重要的作用，但是对于其免疫保护作用的研究很有限。动物实验结果显示，用CbpA的N端免疫动物能够大大提高腹腔或者静脉攻击动物的存活率［18］。由于肺炎链球菌致病机理复杂，CbpA有很大作为疫苗抗原的前景，但需要更多实验结果对其进行验证。然而，由于它可与C3、H因子、pIgR分子相互作用，这些可能会影响PspC作为疫苗的安全性。

5 肺炎链球菌三组氨酸蛋白(Pneumococcal histidine tried proteins，Pht)

Pht是一个裸露在菌体表面的蛋白家族［19］，分子量77～88 kD，都含有一个具有三个组氨酸的模体:HXXHXH。PhtA是在利用计算机对肺炎链球菌全基因序列搜索带有信号肽Ⅱ的蛋白时被发现的［20］，家族成员包括 PhtB、PhtD、PhtE 和 PhtA。Pht A、Pht B和PhtD同源性较高，在前三分之二的序列中有59%～81%同源性。Pht E相差较远，有40%同源性。但三组氨酸模体在蛋白理化性质、生物学活性中的作用还没有被确定。在这类蛋白中，Pht B被研究得比较透彻，已证实在研究过的14个肺炎链球菌血清型中都有表达。在皮下和鼻内攻击肺炎链球菌的动物模型中，Pht B能够起到保护作用，并且可显著降低鼻咽、肺部感染和菌血症的风险。Pht E的免疫作用与Pht B相似，有免疫作用的位点均位于蛋白的C末端，PhtA、PhtD刺激产生保护性抗体，在致死性实验中保护作用为40%和80%。PhtB、PhtD、PhtE也可以作为候选疫苗蛋白，这些蛋白质的性质、生化功能、传播路径等还需要进一步研究。

6 肺炎链球菌保护蛋白A(Pneumococal protective protein A，PppA)

PppA是肺炎链球菌候选疫苗蛋白中分子量最小的蛋白，分子量20 kD。这种蛋白在用磷酸盐缓冲液清洗完整菌体时可以大量获得［21］。免疫电子显微镜观察可见，抗PppA血清可以与菌体表面结合，说明PppA是一种表达在菌体表面的蛋白。序列分析显示，PppA蛋白不是大的开放阅读框的一部分，也没有典型的分泌用信号肽序列。这种蛋白如何穿越膜的机制还不很清楚。该蛋白抗原性保守，序列也高度保守，在实验的各个型别中同源性达92%～97%。PppA的生化功能和在传播中的作用等都还未知。PppA的免疫作用研究也很少，在鼻咽定植的动物模型中产生了高滴度血清抗体，降低了攻击风险。关于PppA仍需要进一步研究。

7 神经氨酸苷酶(Neuraminidase)

Neuraminidase是一种酶，能够把粘液素、糖蛋白、糖脂类的N-乙酰神经氨酸末端从菌体表面切开。生化研究显示，肺炎链球菌至少有两种神经氨酸酶:NanA和NanB，分子量分别是100 kD和75 kD［22］。两个蛋白的氨基酸序列并不一致。目前对NanA研究相对较多。根据序列预测分析，NanA可能有三个结构:氨基端区域、脯氨酸富集区和细胞壁锚定区。这种结构显示，蛋白可能是共价结合在肽聚糖的羧基上，通过跨膜区穿越细胞壁，暴露它的氨基端在菌体外。NanA的发病机制在南美粟鼠耳炎动物模型中得到了验证。如果使NanA突变失活，可以轻易减少实验动物鼻咽部的肺炎链球菌菌体。证实NanA的作用就是在肺炎链球菌入侵时去除上皮细胞表面的硅酸位点，使下面的受体暴露，增强菌体在鼻咽部的定植能力［23］。最新研究显示，在不同型别间，NanA的氨基酸序列和抗原性存在较大变异，这种变化可能影响其成为疫苗的备选蛋白。

8 自溶素(Autolysin)

肺炎链球菌自溶素是一种酶，叫N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶(LytA)。LytA能够降解细菌细胞壁的肽聚糖骨架，能够参与细胞的生长和分裂。这种自溶素的功能在所有肺炎链球菌中均有显示。LytA分子约36 kD，含两个功能区，氨基端负责催化功能，羧基端有胆碱结合区域，使蛋白能够和细胞壁结合［24］。电子显微镜观察证实，LytA也是细胞外表面蛋白，抗LytA抗体可与肺炎链球菌结合。LytA序列在各个型别中都是高度保守［25］。有关LytA的免疫实验进行的也很有限。用纯化的LytA免疫鼻腔攻击肺炎链球菌的小鼠，只能小幅度提高存活时间，不能提高存活率。但是，用腹腔内注射法LytA免疫攻毒的小鼠却能够提高存活率。目前，虽然对这种蛋白的基础研究还很少，由于LytA蛋白序列在各个性别间高度保守，使之成为了蛋白疫苗的候选目标。

9 铁离子转运蛋白(Iron transport protein，PiuA and PiaA)

铁离子在细菌的致病过程中有重要作用，但是，肺炎链球菌本身并不产生交换铁的含铁细胞。研究与肺炎链球菌同源的革兰氏阴阳菌的基因时发现了ABC三种转运蛋白的操纵子:Piu、pia、pit，每个操作子分别编码结合蛋白、透酶、ATP酶。PiuA被研究的比较透彻，它是一种脂蛋白，处在膜外缘，可以结合血红素和亚血红素。但是最近研究显示，高滴度兔抗PiuA和PiaA抗体可以在表面结合，提示这两种蛋白可能存在于细胞的表面。PiuA和PiaA存在于所有23种型别的菌体中。目前，对于这两种蛋白作为备选疫苗的研究十分有限［26］。

10 三种新表面蛋白

典型的疫苗抗原是分泌蛋白和表面蛋白。对肺炎链球菌N4基因进行全基因序列搜索，以寻找这类蛋白，在2 687个潜在开放阅读框中，发现了110个基因带有一个或者多个不同模体的表面蛋白，其中108个片段包括97个完整的基因被克隆出来。相应蛋白也被表达或纯化，并进行了动物实验。其中，6蛋白对通过腹腔注射攻击的小鼠产生保护性作用。包括 endo-β-N-acetylglucosaminidase(LytB，SP46)，1，4-β-N-acetylmuraminidase(LytC，Sp91)和细胞壁相关丝氨酸蛋白酶(Sp128，Sp130)。这些蛋白在23个型别的菌体中无论是序列还是抗原性均保守，并且均可以发现于细胞壁和细胞膜，它们可能是好的疫苗备选蛋白，但是还需要做更进一步的研究［27］。

11 总结

21价荚膜多糖疫苗和7价结合疫苗已具有良好保护老人和孩子免受大部分肺炎链球菌攻击的作用，但是由于型别的限制以及可能发生的致病菌株替换，都要求研制新的、保护力更强更广的蛋白疫苗。由于肺炎链球菌致病机理并不是简单的细胞毒素和细胞溶解，而是极其复杂。从最初鼻咽部的定植到入侵、到发展出症状，如中耳炎、脑膜炎、肺炎、菌血症等，肺炎链球菌都是用不同的毒力因子，在不同的阶段感染和破坏机体组织，同时逃避机体的免疫机制。这些不同的蛋白刺激机体产生的抗体有不同的保护作用。在所研究的蛋白中，PsaA、PspA、PhtB、PppA、NanA能够有效清除50%以上鼻内感染。PspA、PhtB蛋白能够刺激机体产生具有保护作用的抗体，是好的疫苗备选蛋白。几种蛋白的联合应用会产生更加强大和复杂的保护作用，如PsaA、Ply、PspA的联合使用可以在动物模型中产生更加强大的保护作用。如果这些蛋白不能作为疫苗提供有效的保护，它还可以作为一种蛋白载体服务于多糖疫苗，或者作为现在一些疫苗的补充成分，为疫苗中所不能提供保护的型别提供保护。制备蛋白疫苗相对简单、廉价，又具有保护作用强、保护范围广等多糖疫苗所无法比拟的优点，所以，蛋白质疫苗取代多糖和多糖结合疫苗是发展的趋势。

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