张 敏 郭彩霞* 曾翔俊 王红霞 张立克 杜凤和
(1.首都医科大学附属北京天坛医院心内科,北京100050;2.首都医科大学基础医学院病理生理教研室,北京100069)
研究[1]发现心肌缺血/再灌注损伤可以调动心脏自身保护机制,内源性保护物质的释放在心脏自身保护中的作用尤其被关注。晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)是一种膜蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员,和其配体在细胞表面结合,激活细胞内多种信号转导机制,参与糖尿病及其慢性合并症[2]、炎性反应[3]、肾衰竭[4]、心力衰竭[5]、肿瘤生长[6]及神经元分化等多种生理和病理过程。可溶性晚期糖基化终产物(soluble form of receptor for advanced glycation end products,sRAGE)是RAGE的细胞外段部分,可特异结合AGEs,但由于不具有胞内段部分,不能进行信号转导,从而中断上述生物效应对抗多种疾病和病理过程。有研究[7]显示sRAGE可以减轻心脏缺血/再灌注损伤。本课题组前期大体实验[8]也证实内源性sRAGE减少和缺血/再灌注损伤有关,但作用机制尚未明了。其是否直接作用于心肌细胞?是否通过影响氧化应激而发挥作用尚未见报道。
故本文采用缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)大鼠心肌细胞损伤模型,证实外源性sRAGE直接作用于心肌细胞,通过干扰氧化应激,进而拮抗缺血/再灌注损伤而发挥心肌保护作用。
新生(48 h以内)SD大鼠-雌雄不分〔购于北京维通利华实验动物技术有限公司,动物生产许可证编号:SCXK(京)2006-0009〕;超净工作台(上海博讯医疗设备厂);细胞培养箱(Recvo公司,美国);倒置荧光显微镜(Olympus公司,日本);DMEM培养基(Gibco公司,美国);优等胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司);胶原酶I、胶原酶Ⅱ(Sigma公司,美国);胰蛋白酶(Hyclone公司,美国);丝裂霉素C(Roche公司,美国);酶标仪(Biorad公司,美国);噻唑蓝(MTT)(Sigma公司,美国);Cytotoxicity Detection Kit (LDH)(Roche公司,美国);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、一氧化氮(nitric oxide,NO)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光染料(Sigma公司,美国);流式细胞仪(Bechman Coulter公司,美国);sRAGE(北京爱迪博生物科技有限公司)。
采用大鼠原代心肌细胞培养[9]:新生大鼠,消毒胸腹部,开胸,摘取2/3心脏,剪碎(1 mm3),消化酶反复消化,收集上清液,离心(1 000 r/min,10 min),细胞重悬,于5%CO2、37℃条件下差速贴壁30 min,收集细胞悬液加入丝裂霉素C(2g/mL),根据实验所需将细胞接种到培养瓶或培养板中。24 h后第1次细胞换液,72 h后用于实验。
复制心肌细胞缺氧/复氧损伤模型:将72 h细胞放入自制的缺氧罐内,通入混合气体(2%O2、5% CO2、93%N2)3 h后,将细胞取出,放入37℃、5% CO2培养箱中继续培养2 h。
实验分组:①常氧组(Con):细胞正常培养5 h;②常氧+sRAGE组(Con-sRAGE):细胞培养基中加入sRAGE余处理同Control组;③ 缺氧/复氧组(H/ R);④ 缺氧/复氧+sRAGE(H/R-sRAGE)组(实验组):向细胞培养基中加入sRAGE后处理同H/R组。实验结束时分别留取心肌细胞培养液及心肌细胞。
1.3.1 MTT比色法测定心肌细胞活力
筛选 sRAGE干预适宜浓度:不同浓度梯度sRAGE干预H/R心肌细胞(H/R组、H/R+sRAGE 300 ng/mL组、H/R+sRAGE 600 ng/mL、H/R+ sRAGE 900 ng/mL、H/R+sRAGE 1 500 ng/mL、H/R +sRAGE 2 100 ng/mL)接种于96孔板中处理后,每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL),37℃继续孵育4 h,弃上清,每孔加入150 μL DMSO,摇床缓慢振荡10 min,使结晶物完全溶解。用酶联免疫检测仪选择490 nm波长检测各孔吸光度值。
1.3.2 细胞上清LDH漏出含量测定
筛选 sRAGE干预适宜浓度:不同浓度梯度sRAGE干预H/R心肌细胞(分组同MTT)接种于96孔板中处理后,取各组细胞上清液50 μL,按试剂盒操作方法测定LDH。
1.3.3 细胞上清SOD活力、MDA含量测定
各组心肌细胞分别处理后,取细胞上清,分别采用黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法测定SOD、MDA,具体实验步骤按试剂盒操作说明。
1.3.4 DCFH-DA探针借助流式细胞仪检测细胞内ROS水平
各组对数生长期心肌细胞分别处理后,弃去培养基,25 mmol/L HEPES洗 2遍;加入 5 μmol/L的DCFH-DA荧光染料100 μL,37℃避光负载30 min; HEPES洗2遍;加入胰酶消化细胞,1 100 r/min、室温、离心8 min;弃去培养基,HEPES洗2遍,离心;弃上清,加入400 μL HEPES,在流式细胞仪上(激发波长488 nm、发射波长525 nm)以FS和SS为参数,选取活细胞,将其限定在Gate内,进行分析。得到荧光强度值(MIF)所测MIF值与ROS含量呈否比。
1.3.5 细胞上清NO含量测定
各组心肌细胞分别处理后,取细胞上清,采用硝酸还原酶法测定NO含量,具体实验步骤按试剂盒操作说明。
应用SPSS16.0统计软件进行数据分析。实验数据以均值±标准误(±SE)表示,各组间计量资料的比较采用单因素方差(one way ANOVA)分析,差异有统计学意义,则采用最小显著差(least significant difference,LSD)法进行两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。
与H/R组相比,给予不同浓度sRAGE可以改善心肌细胞活力,在900 ng/mL时趋势最明显,差异有统计学意义(图1)(P<0.01)。与H/R组相比,予以外源性sRAGE 900 ng/mL时LDH的漏出量最少,差异有统计学意义(图2)(P<0.01)。
900 ng/mL sRAGE干预培养细胞的 SOD和MDA,与H/R组相比,实验组MDA含量减少(P<0.01),SOD活力增强(P<0.05)(图3、4)。
给予900 ng/mL RAGE后。与H/R组相比,实验组荧光强度降低,即ROS含量降低(P<0.05)(图5)。
与H/R组相比,H/R-sRAGE组NO含量降低(P<0.01)(图6)。
随着冠状动脉溶栓、介入和搭桥等内外科冠状动脉粥样硬化性心脏病(以下简称冠心病)治疗手段的迅速开展,防治心肌缺血/再灌注损伤成为研究的重点[10]。心脏缺血/再灌注损伤机制复杂[11],涉及自由基增多、钙超载、中性粒细胞激活、心肌细胞凋亡、血管内皮功能障碍、能量代谢障碍等。目前普遍认为活性氧大量产生引发的心肌氧化应激在缺血/再灌损伤的病理过程中发挥重要作用[12]。心肌缺血/再灌注损伤过程中产生大量氧自由基,引发链式脂质过氧化反应,损伤膜系统,促使细胞发生氧化损伤,膜通透性及流动性改变;使具有酶活性的蛋白质活性丧失或减弱。而这些损伤可能影响到心肌组织的功能,如能量代谢、离子电流、心肌收缩等方面。
晚期糖基化终产物受体(RAGE)属于多配体受体,表达于心肌细胞的细胞膜上,在成熟的动物及人体中呈低水平表达、当细胞处于激活或应激状态,如糖尿病、炎性反应,受损细胞中RAGE的表达急剧增高。RAGE与晚期糖基化终产物(AGEs)结合,致多个信号传导途径的激活,介导生物效应。sRAGE是RAGE的细胞外段部分,通过RAGE自分泌及基质金属蛋白酶解作用形成,存在于循环血液中,可与细胞膜上的RAGE竞争AGEs,干扰AGEs-RAGE相互作用,由于不具有胞内段部分,不能进行信号转导,所以不介导生物效应,从而拮抗糖尿病慢性合并症、动脉粥样硬化、高血压、缺血再灌注损伤、全身炎性反应综合征、阿尔茨海默病、衰老、癌症等疾病和病理过程的进展。
图6 给予900 ng/mL sRAGE后细胞上清NO含量Fig.6 NO Content in medium*P<0.01 vs control,#P<0.01 vs H/R;sRAGE:soluble form of receptor for advanced glycation end products;NO:nitigen monoxide;H/R:hypoxia/reoxygenation.
Falcone C[13]等研究证实在校正了危险因素后,血清中sRAGE低水平与冠状动脉疾病危险性升高相关;本课题组前期的实验结果[8]显示,内源性sRAGE在常氧组和缺氧/复氧组心肌细胞无差别,但sRAGE下降的根本机制尚不清楚,我们认为其原因可能是内源性sRAGE的生成是神经、体液、心肌细胞共同调节的。本研究采用培养乳鼠心肌细胞,缺氧3 h/复氧2 h造成心肌缺氧/复氧损伤,与H/R组相比,予以不同浓度sRAGE组,心肌细胞活性增加,LDH漏出量减少,LDH漏出量多少可反映细胞膜的损伤,其外漏的程度也可间接反映心肌再灌注受损程度,说明外源性sRAGE直接作用于心肌细胞产生保护性作用,并在900 ng/mL时作用最明显(P<0.01)。
鉴于自由基增多是造成再灌注损伤的主要机制,我们观察sRAGE是否通过影响氧自由基而发挥作用。MDA是脂质过氧化的共同产物,细胞中MDA含量常可反映机体内脂质过氧化的程度,间接反映心肌细胞受自由基攻击的严重程度和细胞损伤的程度; SOD能清除氧自由基,阻断脂质过氧化的链式反应,SOD活力的高低可反映机体清除氧自由基的能力。MDA和SOD是评价心肌缺血损伤的公认指标。由于在复灌阶段,缺血部位的心肌会受到生化物质的突然改变及能量代谢变化的影响。这些变化包括大量ROS产生,线粒体功能异常,心肌细胞内钙离子超载及其他调控机制的异常[14]。在缺血复灌阶段,大量ROS的产生引起心肌细胞氧化应激,导致不可逆转的细胞损伤甚至细胞死亡。本研究表明,与H/R组相比,H/R+sRAGE组可以显著降低MDA含量,升高SOD活力,减少细胞内ROS含量,说明sRAGE能抑制脂质过氧化过程,增强清除氧自由基的能力,降低原代心肌细胞缺氧/复氧所致的胞内ROS升高,提示sRAGE可能通过降低氧化应激来拮抗心肌H/R损伤。这与文献[15]报道的结论一致。
心脏缺血/再灌注损伤诱发NO生成,受NOS调控,NO是一种新型氧自由基,过量的NO可通过产生细胞毒性作用,参与强毒性氧自由基的形成;抑制多种与细胞代谢有关的酶,直接损伤DNA,促进细胞凋亡等途径造成或加重组织、细胞损伤。本实验研究结果显示,与H/R组相比,实验组NO含量降低,差异有统计学意义(P<0.01),提示sRAGE对H/R心肌细胞的保护作用与减少NO的生成有关,从而减少了NO的损伤作用。这与体外实验结果:sRAGE可能通过干扰NOS途径减轻对缺血/再灌注心肌造成损伤的结果相符。NO的生成受eNOS和iNOS共同调控,sRAGE对H/R心肌细胞NO生成的影响究竟是通过干扰何种NOS而产生的,尚不清楚,有待进一步研究。
综上所述,外源性sRAGE可以直接作用于H/R心肌细胞产生保护性作用,其机制可能与抑制氧化应激有关;但其是否还通过其他机制拮抗缺血/再灌注损伤而发挥心肌保护作用,值得进一步探讨。
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