慢性丙型肝炎直接抗病毒药物耐药研究进展

成军

(首都医科大学附属北京地坛医院，北京100015)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染是导致肝硬化、肝细胞癌以及肝衰竭的重要病因之一，全世界约有1.8亿人感染HCV，但仅有50%～60%的患者经Peg-IFN联合利巴韦林标准治疗后可以获得持续病毒与应答(sustained virological response，SVR)［1］。低应答率可能由多种病毒和宿主相关因素所致，此外干扰素(inter feron，IFN)和利巴韦林的不良反应也对治疗剂量以及疗程产生一定的影响［2-3］。因此，临床上迫切需要疗效更高且耐受性更佳的药物。直接抗病毒药物(direct-acting antiviral，DAA)可特异、靶向抑制HCV复制，现已成为抗HCV治疗的研究热点。2011年已有2种药物被美国FDA批准应用于临床，另有多种药物正在进行临床试验［4-5］。现就DAA药物研发现状，耐药特征及其影响因素做一介绍。

1 DAA药物研发现状

根据其作用机制，当前DAA药物主要包括：NS3/ 4A蛋白酶抑制剂、NS5A抑制剂、NS5B RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂，此外还有一些间接抑制HCV复制或目前机制尚未明确的药物。当前各种DAA药物的研发现状表1。其中，Boceprevir和 Telaprevir于2011年5月先后被美国FDA批准用于治疗慢性丙型肝炎［4-5］。

2 DAA药物的耐药特征

与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、艾滋病病毒(human immunodeficiency virus，HIV)耐药相似，HCV对于DAA药物的耐药也可分为基因型耐药与表型耐药。其中表型耐药是指通过体外HCV复制系统证实，HCV序列上某个位点的变异可以导致HCV对于某种药物的敏感性下降，通常采用IC50/EC50的改变来衡量;此外体外复制系统还可用于评价变异本身对病毒复制能力的影响。而基因型耐药是指通过分子生物学方法发现HCV序列上存在表型耐药分析证实的可导致药物敏感性下降的变异。由于现阶段DAA药物中除Boceprevir与Telaprevir之外均处于临床Ⅰ、Ⅱ期研究，因此目前关于这些药物耐药位点的数据大多来源于体外实验的结果。

在DAA药物基因型耐药检测中，直接测序法是当前最常应用的方法，它可进一步区分为PCR产物直接测序和克隆测序。只有当变异株在病毒群中所占比率大于约25%时，PCR产物直接测序法方可检出。而对于克隆测序而言，如果每份标本提取超过80份克隆，则可检出占病毒群比率约5%的变异株。除此以外，还包括杂交分析法、限制性酶切法以及深度测序法等其他检测方法。

表1 抗HCV DAA药物研发现状Tab.1 DAAs in development for HCV infection

2.1 NS3/4A蛋白酶抑制剂

Telaprevir是一种高抗病毒活性但相对低耐药屏障的药物，体外研究［6］共发现以下耐药相关位点，包括V36、T54、R155和A156，它们可单独或联合出现。V36、T54、R155变异可导致低度或中度耐药，而A156V/T可导致高度耐药。病毒的变异是药物压力选择的结果，在选择压力持续存在的情况下，变异株可在病毒群中保持一定比率;但当药物选择压力解除后，变异株能否维持其在病毒群中的比率与其本身的复制能力等多种因素有关。就Telaprevir耐药变异而言，停药随访7～10 d，变异株在病毒群中所占比率显著下降。经过3～7个月的随访，绝大部分变异株被野生株取代［6］。

Boceprevir是一种中度抗病毒活性、相对较低耐药基因屏障的药物，其耐药相关变异位点有V36、T54、R109、R155、A156以及V170［7］。体外实验［8］证实，这些位点变异可导致Boceprevir低度或中度耐药。Boceprevir与Telaprevir存在交叉耐药位点，但相同的变异位点导致2种药物耐药的程度可存在差异。Boceprevir停药时存在耐药变异的患者，随访1年甚至4年后，采用克隆测序分析法仍可检出相关耐药变异［9］。

其他NS3/4A蛋白酶抑制剂大多处在Ⅰ、Ⅱ期临床研究阶段，体外实验也相继提出了这些药物的耐药位点，不同药物之间耐药位点存在差异。总的来说，R155位点是这类药物主要的交叉耐药位点［5］。

2.2 聚合酶抑制剂

HCV聚合酶抑制剂可分为核苷类与非核苷类2种。NM283与R1626是之前研究的两种核苷类HCV聚合酶抑制剂。体外实验［10］表明这2种药物的耐药相关位点分别位于S282T与S96T。遗憾的是，这2种药物的临床试验均因不良事件而终止。R7128是目前正在进行Ⅱ期临床研究的核苷类聚合酶抑制剂，体外研究［10］表明，上述NM283和 R1626耐药相关的S282T与S96T变异均不会导致R7128耐药。

目前在NS5B聚合酶表面至少发现了4个不同的非核苷类聚合酶抑制剂作用位点，相应的药物分别命名为NNI-site1抑制剂、NNI-site2抑制剂、NNI-site3抑制剂以及 NNI-site4抑制剂。NNI-site1抑制剂BI207127具有低到中度抗病毒活性。V494I/A、I424V以及P496A位点变异可导致NNI-site1抑制剂BILB1941敏感性下降。在NNI-site2抑制剂中，Filibuvir正在进行I期临床研究，研究［5］发现M423位点变异可能与患者对 Filibuvir的敏感性下降相关。ANA598属于NNI-site3抑制剂，该药物临床试验未见病毒学突破，但体外实验鉴定出多个该药物可能的耐药位点。NNI-site4抑制剂ABT-333的体外研究证实，C316Y以及Y448C变异可导致该药物耐药，此外临床研究发现S556G与病毒学突破相关。

2.3 NS5A抑制剂

BMS-790052能够与NS5A蛋白第一结构域特异性结合，从而有效抑制HCV，但目前尚无关于该药物耐药的研究［11］报道。

3 影响HCV对DAA耐药的因素

3.1 HCV的异质性

HCV具有较高的转换率，其半衰期为2～5 h。在HCV感染个体中，平均每天产生1010～1012个病毒颗粒。而HCV的RNA依赖性RNA聚合酶保真性较差，且缺乏校正活性，其每个基因组中的每个核苷酸位点出现错配的概率为10－3～10－5［12］。因此在HCV感染患者体内存在大量的异质性序列，即准种。在患者体内的准种中，何种毒株占优势取决于不同毒株的复制能力以及各种已知与未知的病毒与宿主因素。一般而言，患者体内的毒株以野生株为主。根据HCV序列的差异，目前 HCV至少可分为6种基因型(31% ～33%)与超过100种亚型(20% ～25%)［13］。因此考虑到HCV不同基因型以及亚型之间的序列异质性，理论上直接作用于病毒本身的DAA药物对不同基因型和亚型病毒的作用可能存在差异。这一点在Telaprevir针对不同基因(亚)型患者进行的临床试验中得到了证实［14］。

3.2 DAA药物的耐药屏障

DAA药物的耐药屏障由多种因素决定，包括：HCV基因型与亚型、抗病毒活性与药代动力学、患者依从性以及抗病毒药物与HCV相关位点的结合力，此外药物耐药所需要的变异位点的数目以及药物与结合位点之间的结合方式也发挥一定的作用。依据既往的临床试验结果，非核苷类药物的耐药屏障最低，其次为NS3蛋白酶抑制剂，而核苷类药物的耐药屏障最高［5］。

3.3 药代动力学与治疗依从性

目前大部分DAA药物为口服给药。已获准上市的Boceprevir与Telaprevir的半衰期均较短，需每日3次给药。从药物临床试验来看，在Telaprevir的Ⅰ期临床试验中1 250 mg每日2次给药的10例患者中有6例发生病毒学突破与耐药变异;而在750 mg每日3次给药的8例患者中仅有1例发生耐药变异［15］。此外，每日给药次数与药物的不良反应还会影响治疗依从性，从而对耐药的发生起到重要的作用。

3.4 联合治疗与DAA耐药

从HIV与HBV的抗病毒治疗经验中得知，联合治疗有助于延长耐药发生所需要的时间，并增加病毒长期受抑制的概率。DAA药物联合Peg-IFN和利巴韦林的临床试验表明，联合治疗可减少耐药造成的不良影响并获得疗效叠加/协同的效果。如Telaprevir与Peg-IFN和/或利巴韦林联合治疗的Ⅱ期临床试验［16］表明，三联治疗可导致HCV RNA载量持续下降，且无病毒学突破发生;与标准治疗相比，联合治疗可更显著地抑制HCV RNA。目前关于DAA药物的联合治疗仍在探索之中，治疗疗程以及最终获得SVR的情况尚需进一步研究证实。

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