配合物锌-2，5-噻吩二羧酸-邻菲啰啉的合成及其与DNA作用的研究

徐 进， 姜美平， 武光磊， 高恩军

(1.沈阳化工大学应用化学学院，辽宁沈阳110142;

2.沈阳市无机分子基材料化学(国际)重点实验室，辽宁沈阳110142)

顺铂是典型的无机抗肿瘤药物，但有较大的毒副作用，为了克服这一不足，科学家对其它金属配合物的药物前期基础性进行了研究.过渡金属配合物在配位化学和生物无机化学学科具有重要的作用，锌是组装配位化合物时常选用的金属元素，离子易与含N、S配位原子的配体形成配位化合物.过渡金属配位化合物的潜在应用前景激发了人们的研究兴趣，大量的配位化合物已被制备出来，其结构和性能已被深入研究.金属锌配合物在生命科学中具有重要作用，对肿瘤细胞具有较强的抑制活性［1－5］.通常，DNA分子是抗癌化合物作用的主要靶标，而光谱学技术是研究化合物与DNA作用程度及探讨反应机理的重要手段.为进一步探讨锌混合配体配合物与DNA作用机理，我们以2，5-噻吩二羧酸(thca)和邻菲啰啉(phen)为配体，合成了锌配合物［Zn(thca)(phen)(H2O)］.借助紫外光谱、荧光光谱和凝胶泳法，研究配合物与DNA的作用规律，使用本实验室培养的Hella细胞进行了细胞凋亡实验，得到较为重要的实验结果.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker smart 1000 CCD-X射线单晶衍射仪;PHS-3C精密数显酸度计;D-MS-I磁力搅拌器;岛津 UV2240紫外可见光谱仪;日立23010荧光光谱仪;上海JS-380A自动凝胶图像分析仪.

氯化锌、2，5-噻吩二羧酸、邻菲啰啉均为分析纯试剂;HC-DNA从本实验室培养的Hella细胞提取;pBR322 DNA为生化试剂.

1.2 配合物的合成

将10 mL、10 mmol/L的ZnCl2与10 mL、10 mmol/L的2，5-噻吩二羧酸(碱溶)混合，搅拌4 h，将10 mL、10 mmol/L的邻菲啰啉(醇溶)加入混合溶液，持续搅拌2 h，然后用0.8 mol/L KOH溶液调节混合液pH值为6.42，经过滤得到澄清溶液于小烧杯中，用保鲜膜封口，置于空气中，经过几周的溶剂挥发得到晶体.经过Bruker Smart 1000 CCDC-X射线单晶衍射仪确定了以上所得晶体的结构为［Zn(thca) (phen)H2O］配合物.

1.3 配合物的结构

配合物的结构如图1所示.

图1 配合物配位结构Fig.1 Complexes with structural H atoms are all omitted

配合物晶体结构中主要的键长(nm)如下: Zn(1)—O(1):0.199 06(14);Zn(1)—O(1W): 0.203 62(14);Zn(1)—O(4)#1:0.206 54(14); Zn(1)—N(2):0.209 57(18);Zn(1)—N(1): 0.217 20(17).

配合物晶体结构中主要的键角(°)如下: O(1)—Zn(1)—O(1W):128.69(6);O(1)—Zn (1)—O(4)#1:95.17(6);O(1W)—Zn(1)—O (4)#1:88.60(6);O(1)—Zn(1)—N(2): 104.12(6);O(1W)—Zn(1)—N(2):126.92 (6);O(4)#1—Zn(1)—N(2):91.87(6); O(1)—Zn(1)—N(1):95.27(6);O(1W)—Zn(1)—N(1):90.75(6);O(4)#1—Zn(1)—N(1):167.12(6);N(2)—Zn(1)—N(1):78.26 (7).

其他晶体数据:F(000)=880;R(int)= 0.016 0;Z=4;－12≤h≤13，－18≤k≤17，－13≤l≤10;R1=0.027 1，wR2=0.071 1(I＞2σ(I));R1=0.029 8，wR2=0.072 7(all data).中心锌离子为五配位，显现出不规则四棱锥结构(见图1).为了使得配合物的结构更清晰，H原子全部被省略.

1.4 配合物与HC-DNA作用的光谱测定

1.4.1 配合物与HC-DNA作用的紫外光谱测定图2为一定浓度的配合物(2.0×10－6mol/ L)掺入到不同浓度DNA后的紫外吸收光谱图.

图2 配合物与DNA作用的紫外光谱Fig.2 UV spectra of complexes with DNA

配合物在波长为200～400 nm范围内均有吸收峰.所有这些紫外光谱的最大特征吸收均为芳香氮碱配体内的π-π*电子跃迁形成，配合物分子内电荷迁移光谱的波长相对较长，归属为MLCT谱［6－8］，其吸收强度较比π-π*弱.DNA的掺入使配合物各特征吸收峰在波长发生红移的同时，发生明显的减色效应，DNA浓度越大，则上述趋势越明显.这是由于配合物以插入方式与DNA螺旋碱基对结合，发生的π电子堆砌作用，使其配体上π*空轨道与碱基的π电子轨道发生偶合，能级下降，从而导致π-π*跃迁能减小，产生红移现象;同时，偶合后的π轨道因部分填充电子，使 π-π*跃迁几率减小，产生减色效应［9］.

1.4.2 配合物与HC-DNA作用的荧光光谱测定

溴化乙锭(EB)具有共轭芳香环的平面结构，能专一平行地嵌入DNA双链的配对碱基之间.在水溶液中，其本身荧光极弱，而DNA分子几乎没有荧光.但当溴化乙锭插入双链DNA分子之后，溴化乙锭分子借助其与碱基之间的堆积作用而能平行地“固定”在DNA分子内部，从而使溴化乙锭分子平面刚性增加，碰撞淬灭减小，发出的荧光强度约提高10倍［10］.溴化乙锭不能插入单链DNA中，而只能插入双螺旋DNA分子中.因为它与DNA的插入作用是通过碱基间堆积而产生的.因而，溴化乙锭是一种能与DNA双链发生专一插入作用，且选择性好，灵敏度高的荧光探针.

溴化乙锭(EB)插入DNA后使DNA原来的紧密螺旋松弛，阻碍了DNA的进一步转录复制，进而影响生物体的繁殖.如果所合成的药物(M)与EB的结构相似且本身荧光很弱，就能与DNA发生类似EB的插入作用，而竞争EB与DNA结合的位点，释放出EB，使EB/DNA复合体系荧光减弱:M+EB·DNA=M·DNA+EB.同时可通过跟踪此体系的荧光变化来说明药物(M)与DNA结合能力的强弱.根据经典的斯特恩-沃尔默(Stern-Volmer)方程［11］可说明药物对DNA插入作用的强弱.

其中:I和 I0分别代表复合物(配合物/EB/ DNA)中存在和不存在配合物时的荧光强度;r为复合物中配合物与DNA的浓度比;Ksq表示斯特恩-沃尔默(Stern-Volmer)淬灭常数，其可以定量描述配合物与DNA作用的强弱.从Ksq值的大小就可以定量地比较几个化合物在相同条件下与DNA作用的强弱程度，Ksq值越大，作用强度越大，结合能力越强.

通过荧光法测定配合物与自提HC-DNA发生相互作用的结果见图3及图4.

从图4中可以看出配合物的淬灭常数Ksq= 0.203，对HC-DNA具有一定的插入能力;从图3中可以看出:随着配合物浓度的增加，DNA-EB复合物的体系荧光强度均逐渐减弱，且发生了不同程度的淬灭，并且浓度越大，荧光猝灭逐渐趋于平衡.

图3 不同浓度的配合物与DNA作用的荧光光谱Fig.3 Fluorescence spectra of the complexes with DNA

图4 配合物与DNA-EB体系作用的淬灭常数(0.203)Fig.4 Interaction with the DNA-EB system，the role of the quenching constant(0.203)

1.5 凝胶电泳法研究锌配合物对pBR322-DNA的切割作用

在外电场的作用下，带电荷物质会向着与其所带电荷电性相反的电极移动.DNA中存在有亲水性的磷酸基团，在高于其等电点的缓冲溶液中带负电荷，可使DNA在电场中通过凝胶介质向正极泳动;影响DNA在凝胶介质中移动的因素主要有电荷效应、凝胶介质的分子筛效应.在电荷相同的条件下，凝胶介质的分子筛效应至关重要，其与分子量大小及构型有关;分子量越小，空间构型产生的空间位阻越小，迁移位置就越靠前，而DNA带间的距离也就越大.如pBR质粒DNA存在共价闭环(ccc)、单链开环(oc)和线性(linear)三种空间构型;由于ccc分子结构最为紧密，oc分子结构最为松弛，因而在一般情况下，ccc在最前，oc在最后，而linear介于二者之间.当共价闭环型(ccc)DNA的一条链上出现一个缺口(nick)时，超螺旋结构解开，形成开环型(oc)结构.若两条链在同一位置发生断裂时，则成为线形分子(linear).某些能插入DNA双螺旋碱基对之间的试剂，如EtBr、放线菌素D，可以改变DNA的超螺旋状态，使负超螺旋减少，以至完全松开形成oc甚至形成正超螺旋，进而能通过凝胶电泳实验表现出来［12－13］.本文基于上述原理及前面的荧光法实验结果，以凝胶电泳实验来研究配合物对DNA的切割作用.

图5是配合物的凝胶电泳实验结果.Lane 0是纯的pBR322-DNA alone，Lane 1～4为4个不同浓度配合物与DNA在有氧的条件下反应1 h的电泳图像.配合物的4个不同浓度1、2、3、4分别是 5.0 μmol/L、2.5 μmol/L、1.25 μmol/L、0.625 μmol/L.从图5可以看出:随着化合物的浓度的增加，FormⅠ在逐渐地减少，FormⅡ也在逐渐地减小，并且FormⅠ、FormⅡ都比Lane0要小.此现象表明了这些配合物对pBR322-DNA具有一定的切割能力.锌配合物对pBR322-DNA的切割，再次证明了配合物是以专一的插入方式与DNA发生作用的.

图5 配合物对pBR322-DNA的切割电泳图Fig.5 Electrophoresis of pBR322-DNA cutting via complexes

1.6 锌配合物对HeLa细胞凋亡实验的研究

对于贴壁生长的HeLa细胞，让其在盖玻片上面爬行生长.经浓度为5 μmol/L顺铂作用，配合物处理24 h后，取出盖玻片，经PBS轻轻漂洗后，用乙醇在常温下固定5～10 min，即可染色，固定(fication)的目的是保持细胞自然形态，防止细胞自溶和细菌所致的腐败;固定液能沉淀和凝固细胞内蛋白质和破坏细胞内溶酶体酶，使细胞不但保持自然形态，而且结构清晰，易于着色.着色过程如下:苏木精液染5～15 min→流水稍洗去苏木精液1 min→盐酸乙醇分化30 s→稍水洗10～30 s→促蓝液返蓝10～30 s→流水冲洗10～15 min→蒸馏水过洗1～2 s→伊红液染色2 min→蒸馏水稍洗1～2 s→95%(体积分数)乙醇(Ⅰ)1 min→95%(体积分数)乙醇(Ⅱ)1 min→无水乙醇1 min.

细胞凋亡［14－17］又称细胞程序性死亡，是指细胞在一定的生理和病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程.细胞凋亡不同于细胞坏死，是程序性死亡过程的一种主要形式，强调的是形态学上的改变.细胞凋亡与细胞坏死的简单区别见表1.

表1 细胞凋亡与细胞坏死的简单区别Table 1 The simple difference between apoptosis and necrosis

将处理好的爬片放在光学显微镜下进行观察、拍照.从图6(a)中可以看出:正常HeLa细胞在染色后呈不规则的多角形，细胞与细胞间连接紧密，细胞核完整，染色体均匀淡蓝色，属正常生长状态.图6(b)是顺铂作用后HeLa细胞凋亡的形态，细胞间隙增大，细胞变圆，变小，细胞核染色质固缩，集聚至核周边呈月牙形斑块，胞核深染，染色质成团块状，细胞表面有出芽现象，并伴有凋亡小体.配合物作用过的细胞也发生了类似的变化，如图6(c)，可明显地观察到凋亡的形态学特征.由此看出，HeLa细胞在配合物的作用下发生了不同程度上的凋亡.

图6 染色后HeLa细胞在显微镜下的形态Fig.6 The shape of the staining of HeLa cells under the microscope

2 结束语

采用常温溶剂挥发的方法合成了1个锌(Ⅱ)配合物，分子式为［Zn(thca)(phen) (H2O)］(其中thca:2，5-噻吩二羧酸，phen:邻菲啰啉).用X-射线单晶衍射技术测定了配合物的晶体结构单元.配合物与HC-DNA作用的紫外光谱研究表明:配合物在200～400 nm波长范围内有明显的特征吸收峰，表现为分子内π-π*电子越迁.加入HC-DNA后，配合物的紫外光谱均发生减色效应和红移现象，说明配合物能与HC-DNA发生嵌插作用.配合物与HC-DNA作用的荧光光谱研究表明:DNA/EtBr复合物中加入配合物后，发生荧光猝灭现象，这说明配合物能与溴化乙锭竞争插入DNA碱基对中.配合物电泳实验表明:配合物对pBR322-DNA具有一定的切割能力.细胞凋亡实验结果表明:配合物对HeLa细胞有一定的杀伤能力，对HeLa细胞呈现出明显的细胞凋亡现象.

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