毕赤酵母重组表达抗菌肽Fowlicidins的研究进展

东北农业大学动物营养研究所 许文杉 冯兴军

抗菌肽因具有分子量小、热稳定性高、杀菌范围广、作用机制独特等特点，成为抗生素替代品的重要候选物，但其制备一直是研究与应用的瓶颈。基因工程方法是解决抗菌肽制备难题的有效途径。巴斯德毕赤酵母表达系统（Pichia pastoris）是目前抗菌肽基因和生物工程中重要的、应用最为广泛的表达系统之一，该系统是20世纪80年代初兴起的一种新型真核表达系统，具有基因重组操作相对简单、能正确加工与修饰外源蛋白、表达量高、易纯化且易大量发酵培养等优点。迄今为止，已有400多种蛋白在该表达系统中成功高效表达（Cereghino和Cregg，2000）。运用毕赤酵母表达系统表达Fowlicidins抗菌肽具有一定的现实意义。Fowlicidins是鸡体内的一类新型的Cathelicidin抗菌肽，其前体分子的氨基端含有一个高度保守的cathelin前片段，而羧基端的氨基酸序列具有特异性，具有广谱的抗菌活性和避免抗菌剂耐药性的潜能，是理想的候选抗菌药物。

1 Fowlicidins的基本简介

1.1 Fowlicidins的基因结构和组织分布 迄今为止，已在鸡基因库中搜索到13种鸡β-防御素，4种cathelicidins和1种新的肝脏表达的抗微生物肽（LEAP-2），其中cathelicidins的研究主要集中于哺乳动物有关于鸡的研究报道较少（Ramanathan 等，2002）。 鸡 cathelicidins包括 Fowlicidin-1 （cathelicidin-1，chCATH-1）、Fowlicidin-2（cathelicidin-2，chCATH-2）、Fowlicidin-3（cathelicidin-3，chCATH-3） 等 （Goitsuka 等 ，2007）。Fowlicidin在N端有一个高度保守的cathelin前序列，属于cathelicidin家族。编码Fowlicidins的3个基因都具有相似的结构，即4个外显子被3个内含子间隔开来，起始的3个外显子编码信号肽和cathelin前片段，而最后的一个外显子主要编码成熟片段。这种基因结构类型与哺乳动物Cathelicidins基因结构类型是完全一致的，明确地指示出Cathelicidins基因在生物进化过程中有重要的保守性（Herr等，2007；Mookherjee 等，2007）。从Fowlicidins的起源来看，Fowlicidin-1和Fowlicidin-3的产生很可能是基因复制的结果，因为其整个可读框有着明显的相似性，并且其基因的内含子片段也有很高的相似性。Fowlicidin-2与Fowlicidin-1和Fowlicidin-3相比，在前三个外显子编码的肽片段上同样有着明显的同源性，但是在最后一个外显子编码的肽片段上却有着很大的不同，或许Fowlicidin-2基因是直接从Fowlidicin-1或Fowlicidin-3复制而来的，但不是经过外显子改组而得来的，因而，家禽（鸡）可能借此方式产生了在最后一个外显子上有明显序列趋异的多种Cathelicidins（史春林，2008）。

成熟的鸡Fowlicidins是富含精氨酸的单链分子，氨基酸数量为26～32，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯杆菌、产单孢李氏菌等细菌对其高度敏感。Albert等（2005）从鸡骨髓细胞中克隆出一种新奇的鸡cathelicidin——鸡骨髓抗菌肽，命名为 CMAP27。 随后，Xiao 和 Yi（2006）从鸡肝脏中克隆出3种鸡Cathelicidins，即Fowlicidin-1，Fowlicidin-2和Fowlicidin-3，其中Fowlicidin-3与CMAP27通过序列比对有100%同源性，应该视为同一抗菌肽。Fowlicidins在盲肠扁桃腺、法氏囊和骨髓中的表达量很高，在皮肤组织有表达量较低，但是在尾脂腺中却有极高的表达量。以上此类分泌型的腺油脂含有抗菌特性的烷基代石蜡酸和乙醇，可以为禽类抗感染提供保护作用。鉴于Cathelicidin类抗菌肽在与哺乳动物皮肤相关的先天免疫中发挥重要的效应作用，或许Fowlicidins对宿主也有同样的作用 （Zanetti等，2002；Cole等，2001）。因此，Fowlicidins短肽与腺油脂一同分泌，遍布全身羽毛和皮肤，其可能对抗皮肤病原菌的先天免疫有重要作用。

1.2 Fowlicidins的抗菌特性和抗菌机制 Fowlicidin-3在毕赤酵母中的表达产物对大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌均有一定抑菌活性，目的蛋白分子质量约3.1 kDa，所表达的抗菌肽Fowlicidin-3有作为抑菌药物的潜力 （陈轶群等，2009）。鸡源Fowlicidin-3抗菌肽具有较强的热、酸稳定性，对致病性大肠杆菌K99、鸡白痢沙门氏菌和金黄色葡萄球菌CowanⅠ的最小抑菌浓度分别为 3.12、1.56μg/mL 和 1.56μg/mL。 在对大肠杆菌O1感染雏鸡的体内疗效试验中，鸡源Fowlicidin-3显示出了较好的预防和治疗效果（李荣荣等，2011）。相对而言，重组抗菌肽Fowlicidin-1的抑菌作用更为广泛，对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、产单孢李氏菌、金黄色葡萄球菌均有抑制作用（史春林，2008）。还有试验数据表明，Fowlicidins对细菌的最小抑菌浓度在0.4～2.0μg/mL，并有较强的结合内毒素能力，而且还具有强有力的、不依赖盐离子的、广谱的抗菌活性，是目前已知的活性最强的抗菌肽之一 （Xiao和Yi，2006）。Fowlicidins抑制大肠杆菌所需的最小药物浓度（MIC）为1.59～2.66μg/mL。SMAP-29是目前所报道的最有效的Cathelicidin抗菌肽，与其相比，Fowlicidins表现出很强的抗菌特性 （Zanetti等，2002；Shin等，2001）。但是，与多数抗菌肽不同的是Fowlicidins抗菌活性不受生理盐浓度的影响，甚至在NaCl浓度为150 mmol/L时，仍然保持着抗菌活性，并且对抗性菌株有很强的抑制作用，这意味着Fowlicidins在抗感染治疗应用上有着很大的潜力。

到目前为止，Fowlicidins的确切抗菌机制还没有被确定。普遍认为Fowlicidins是通过在微生物壁膜上形成多聚体孔道而裂解细胞的。Bommineni等（2007）研究表明，Fowlicidins是以多聚体的形式作用于微生物膜壁上，并在其上形成膜孔；Fowlicidins首先以单体或多聚体的形式通过静电作用结合在膜上，然后互相识别形成多聚体并插入到膜的疏水核中，并与膜的脂层相互作用形成通道；同时其他单体或小的多聚体继续结合上来使通道的孔径扩大，细菌因而失去膜势，不能保持正常渗透压而死亡。显然，不同的抗菌肽采用不同的抗菌机制，并且对于一个给定的抗菌肽其作用模式同样因作用菌种的不同而有所不同（Ramanathan等，2002）。 因此，进一步探究 Fowlicidins的疏水性、净带正电荷量、构象的柔韧度以及二级结构与其抗菌作用之间的相互关系，对揭开Cathelicidins类抗菌肽的作用机制及其在抗感染应用方面都有积极意义。

2 Fowlicidins在毕赤酵母中的表达

2.1 毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母表达系统具有继代稳定，可以高密度发酵，在发酵过程中自身分泌的蛋白少，外源蛋白表达量高等优点，而且在其分泌表达抗菌肽时，自身不受其杀菌活性的影响，还能保证抗菌肽分子的正确结构和适度的糖基化，从而保证其天然活性，是一种高效蛋白表达体系（唐元家和余柏松，2002）。

2.2 影响Fowlicidins表达的因素 在毕赤酵母表达系统中，影响Fowlicidins外源性基因表达因素有目的基因的拷贝数、目的基因的特性、甲醇利用表型、产物稳定性和培养条件等。

2.2.1 目的基因的拷贝数 由于基因的剂量效益，随着克隆中拷贝数的增加，蛋白质的表达可能会增加。多拷贝整合有利于充分发挥毕赤酵母的表达潜能。Vacca等（2000）的研究结果显示，在1～8整合拷贝数范围内，HBsAg表达量随基因剂量的增加而成比例升高。也有极少研究表明，增加拷贝数反而降低了表达水平（Karine和Dev，2010）。由此可见，基因整合拷贝数与表达水平间并不是简单的正比关系，有时拷贝数增加反而会对表达产生负效应，高拷贝低表达的原因可能在于mRNA翻译、蛋白质折叠效率的限制，这和目的蛋白的大小、结构有很大关系。基因拷贝数对表达量的影响很难预测，所以在获得多拷贝重组子的基础上，要进一步筛选确定因具有合适拷贝数而显示最佳表达水平的菌株，也就是高表达菌株的筛选应以表达的蛋白量为最终标准。可利用SDS-PAGE、菌落免疫印迹和活性分析等方法检测目的蛋白质的表达水平。

2.2.2 目的基因的特性 由于特定的A+T富含区可作为多腺苷酸或转录终止信号，因此高A+T含量的外源基因在此系统中不能有效的转录 （李琦等，2005）。外源基因序列中的mRNA 5’端非编码区（5’-UTR）的核苷酸序列和长度是影响外源基因能否高效表达的又一重要因素。此外，在设计基因时选用毕赤酵母偏好密码子可提高转录的成功率。

2.2.3 甲醇利用表型 使用不同的宿主菌或线性化酶切位点，可产生不同的甲醇利用表型。然而很难将转化子表型与表达量之间建立明确和必然的关系，应根据试验情况，考察自身基因在各表型各菌株中的表达情况，最终选择特定的株型（Dai等，2000）。

2.2.4 产物稳定性 外源蛋白对蛋白酶的敏感与否也影响蛋白的产量。通常采用调整pH改变酶活性；培养基中添加1%酪氨酸蛋白水解物；或使用蛋白酶缺陷受体菌SMD1168来减少蛋白酶对外源基因表达的影响（Sreekrishna等，1997）。

2.2.5 培养条件 外源基因的表达水平受培养基组成、缓冲液pH、甲醇浓度、培养温度、通气状况、诱导物浓度及时间等因素的影响。

3 展望

随着对Fowlicidins等相关抗菌肽研究的不断深入，必将开创治疗微生物感染类疾病的新纪元。考虑到Fowlicidins有着强有力的、不依赖盐离子的、广谱的抗菌活性，在机体免疫中有一定调节作用；而且其抗菌机制完全不同于传统抗生素，因此通过基因工程方法，利用细胞依赖或无细胞型蛋白表达系统生产重组Fowlicidins抗菌肽将会有重大意义（Ingham和Moore，2007）。目前研究的重点是如何实现抗菌肽产量的突破，以满足试验研究及临床应用的需求。随着Fowlicidins表达量的不断提高，对其抗菌机制的深入研究、临床抗微生物活性鉴定及在其他药学应用上的评定有很大推进作用。

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