弓形虫脑炎的神经系统损伤及其病理机制＊

王 璐，沙 泉，沈继龙

弓形虫（Toxopl asma gondii）广泛寄生于人和动物的有核细胞内，是人兽共患寄生虫病的重要病原体之一。据血清学调查，全世界约有三分之一左右的人呈隐性感染［1］。弓形虫具有嗜神经性，神经系统疾病与弓形虫感染关系密切，且中枢神经系统病变是该病最为严重的类型之一。在免疫功能正常的机体内，弓形虫感染主要呈慢性隐性感染状态；而在免疫功能缺陷的宿主，如AIDS、器官移植患者、肿瘤放化疗以及大量免疫抑制剂的应用，可引起中枢神经系统损害和全身播散性感染。是造成患者死亡的继发病因之一。诸多研究显示，弓形虫慢性中枢神经系统的感染可以改变人和动物的行为和认知功能，例如癫痫和精神分裂症等［2－4］。因而对于弓形虫脑炎的研究甚为重要，本文主要探讨弓形虫脑炎的病理损伤及其分子机制。

北美和欧洲的弓形虫虫株主要分为type I，type II和type III 3种基因型［5］，分别通过虫体的分泌型细胞器致密颗粒（dense granules，GRAs）和棒状体（r hoptries，ROPs）分泌的不同蛋白来调节宿主的免疫反应。其中type I和type III分泌的GRA15不能活化感染细胞的NF－κB，且ROP16持续诱导STAT6和STAT3活化，从而限制IL－12，IL－1β和IL－6等前炎症因子的产生［6］，最终使得弓形虫在宿主体内大量复制产生病理损伤。而type II表达GRA15的活化形式，能激活感染细胞的NF－κB［7］，且 低 功 能 形 式 ROP16 引 起 STAT6 和STAT3短暂的活化，进而在感染的早期有大量的前炎症因子产生，且虫体诱导T细胞向Th1型转化，导致弓形虫在宿主体内缓慢复制。

1 神经系统损伤

弓形虫的致病作用与虫株毒力、基因型和宿主的免疫状态密切有关。虫体侵入人体后，籍其寄生的有核细胞，尤其是单核巨噬细胞随血液进入全身许多器官和组织。弓形虫有3种分泌型细胞器，包括棒状体（rhoptries，ROPs）、微线体（micronemes，MICs）和致密颗粒（dense granules，GRAs），这些器官分泌的蛋白以纳虫泡（parasitophorous vacuole，PV）的形式进入宿主细胞，甚至构成纳虫泡膜（PV M）的一部分。Ahn见到，其中GRA10与细胞核和核仁内的STAT6、TAF1B和Ran BP1有着特殊的关联，能调节宿主的TAF1和P38 MAPK，它能进入宿主细胞核是通过核仁定位序列（No LS），即GRA10的199－213任意重复的赖氨酸和精氨酸片段［8］。

在宿主有效的免疫应答产生后，大部分虫体可被巨嗜细胞杀灭，但由于弓形虫具有嗜中枢神经系统的亲和性，脑部的血管丰富［9］，以及抗体不易通过血脑屏障等，致使细胞内残存的虫体得以在脑、眼、肌肉等组织内潜存数月、数年乃至宿主一生。当机体免疫系统功能低下时，包囊破裂，囊内的缓殖子转化成速殖子大量增殖并释放，可导致局灶或播散性脑膜脑炎［10］。局部的抗原抗体反应引起细胞水肿及毛细血管周围炎症或微血栓形成，导致脑微循环障碍。先天性弓形虫脑膜脑炎表现为脑积水、小头畸形、抽搐、智能迟钝及颅内钙化；而获得性的脑病主要表现为头痛、脑膜刺激征，以及癫痫发作等。弓形虫脑病的CT特征为皮质多发片状肉芽肿、基底节有条索状或脑室周围为主的双侧对称性钙化影及脑积水征［11］。

Caspase是一组天门冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶，是细胞凋亡中最为关键的酶，被激活后可发生连续的级联反应，水解胞浆底物，激活特定的核酸酶，导致凋亡发生。此外，cyt C是线粒体呼吸链的重要组成部分，在细胞凋亡中发挥着重要作用，是第一种被发现的线粒体释放的促凋亡蛋白。周永华等［12］发现，弓形虫慢性感染大鼠10周后，其海马神经细胞的凋亡率与正常对照组相比明显增加，且cyt C和caspase－3的蛋白表达上调，而线粒体膜电位明显下降。因而推测其机制是海马神经细胞被弓形虫感染后，或受虫体分泌排泄物的影响，大脑供能系统障碍，三羧酸循环被破坏，导致其线粒体肿胀，膜mPTP开放增强，使大鼠海马神经细胞线粒体磷脂含量及膜的流动性下降，引起膜电位崩解，促进cyt C的释放，激活caspase－3等酶的级联反应，启动凋亡程序，导致细胞凋亡。

Gretchen等见到，弓形虫感染小鼠5～12个月（相当于人从幼年到中年），脑部MRI改变最明显的区域是导水管周围和脑室周围，这与人先天性感染的情况相似：先天性感染的婴儿和小鼠由于导水管周围的炎症都会形成脑积水。MRI和组织病理学发现，在慢性感染小鼠脑室周围有ABCA4基因的表达，它能将有毒的氧化脂质转运出细胞，而它的等位基因与人先天性感染形成的脑积水有关。此外，VCAM 和ICAM 基因也与弓形虫感染有关，其中弓形虫微线体蛋白2（MIC2）与VCA M相关联，在弓形虫入侵细胞时发挥重要作用。进一步的说明了弓形虫分泌的产物能改变一些重要基因的表达，这些基因与神经发育、感染神经元的死亡以及脑部免疫功能的改变有关［13－15］。Miller研究表明位于海马的血管套增加了神经前体细胞和脉管系统的正常距离，这与小鼠认知功能减低有关［16］。

2 分子病理机制

2．1 杀伤性小胶质细胞 脑组织寄居的小胶质细胞起源于CD45＋骨髓前体细胞，它在出生前迁移到脑组织，尔后进入脑实质，形成一群能自我更新的细胞群［17－18］。中枢神经系统是免疫豁免器官（i mmunologically privileged organ）之一，因为它有相对选择性不渗透的血脑屏障和免疫抑制的微环境来限制免疫细胞的进入。但是小胶质细胞能直接对亲神经性的病原体首先发生反应［19］。因此小胶质细胞是中枢神经系统固有免疫应答的主要成分［20］。在弓形虫感染时，小胶质细胞分泌INF－γ，诱导前炎症因子和趋化因子产生［21］，和T细胞一起发挥抗弓形虫脑炎的作用［22］。尽管小胶质细胞的活化和神经炎症是重要的宿主防御机制，能保护中枢神经系统防止感染的扩散，但是慢性的小胶质细胞活化对神经元是有害的，可通过持续分泌神经毒性分子，如NO、S100β以及前炎症因子TNF－ɑ等导致组织的损伤［23］。

活化的小胶质细胞通过不同的机制具有2种不同的功能：包括促进神经元再生和杀伤神经元［24－26］，依据不同的功能分别称为杀伤性小胶质细胞和保护性小胶质细胞。He等证实感染弓形虫的小鼠小胶质细胞能够迅速活化，高表达TNF－α、NO和CCL25，损伤神经元。流式细胞术检测感染弓形虫的小胶质细胞CCR9表达为78%，且CCL25能诱导感染弓形虫的小胶质细胞趋化迁移，在海马区还有免疫应答基因（i mmunoresponsive gene 1；Ir g 1）表达，这表明小胶质细胞主要是通过表达的趋化因子受体CCR9，趋化因子配体CCL25以及免疫应答基因Ir g1即CCR9／CCL25／Ir g1通路发挥作用的，将这种CCR9＋Ir g1＋的细胞称为杀伤性小胶质细胞［27］。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是细胞内的一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，该信号蛋白家族主要包括细胞外信号调节激酶（ERK1／2）、C－jun氨基末端激酶（JNK）和P38 MARK。其中与EKR相关的细胞内信号转导途径被认为是经典MARK信号转导途径，而P38／MARK通路的激活剂和JNK通路相似。Zhong等通过体外实验将活化的小胶质细胞和神经元共培养，48 h后经台盼蓝染色神经元被染成蓝色，并且随着时间的延长，神经元存活率逐渐下降，到第5 d只有20%，用免疫印迹法检测到MAPK的表达，说明MAPK参与小胶质细胞的活化和神经元的凋亡，明确了小胶质细胞诱导的神经元凋亡是通过MAPK信号通路诱导的。分别加入MEK1／2的抑制剂 U0126、JNK1，－2，－3的抑制剂SP600125和p38的抑制剂SB203580 3条 MAPK通路的抑制剂，培养48 h后，用台盼蓝检测神经元存活率，证明主要是JNK MAPKs和P38 MAPKs信号通路可以保护神经元［28］。

2．2 神经元和神经干细胞 弓形虫持续寄生在中枢神经系统，神经元是弓形虫入侵的主要靶细胞，且神经元不能限制弓形虫的入侵和增值，即使加入外源性IFN－γ也不能保护神经元。慢性弓形虫感染主要形成包囊，超微结构显示组织包囊主要也在神经元细胞内。新生大鼠的海马神经元很少被弓形虫感染［29］，而胎鼠的皮层神经元则有虫体寄生，可能是由于大鼠不同育龄或不同区域的神经元对弓形虫的敏感性不同。神经元的损伤可能是当其细胞膜被破坏时，缓殖子会募集单核细胞，释放大量的炎性因子，导致神经损伤。Evans等研究发现神经元表面表达天然抗性相关巨噬细胞蛋白（nat ural resistance associated macrophage pr otein，Nramp1），能影响弓形虫的死亡率［30］。

Bcl－2相关蛋白主要包括促进凋亡分子如bax和抑制凋亡分子如bcl－2，它们在中枢神经系发育过程中表达，且在神经元损耗中发挥重要作用［31］。Junko等研究发现，感染弓形虫的小鼠在脑部能见到明显的皮质发育不良，而在弓形虫感染和未感染的孕鼠中bax表达并无明显差异，说明bax诱导的凋亡与弓形虫感染导致的皮质发育不良无明显关系，但是可能有其他的凋亡蛋白如TNRF与弓形虫感染诱导的凋亡有关［32］。

体外实验将弓形虫和神经元共培养发现，感染的神经元能分泌巨噬细胞炎性蛋白（MIP－1α、MIP－2β）、转化生长因子TGF－β1，能够募集T细胞、巨噬细胞和粒细胞，发生炎症反应，而不产生IL－10、GM－CSF等胶质细胞分泌的趋化因子。神经元是否分泌趋化因子与弓形虫的期特异性有关，因为在弓形虫脑炎中包囊周围未见炎性细胞浸润［33］。神经元周围的其他细胞如小胶质细胞、星形胶质细胞等分泌的炎性因子也会对神经元产生神经毒性损伤，如活化的小胶质细胞通过产生NO等损伤神经元［34］。

神经干细胞（NSCs）具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞。其主要生物特性包括：多向分化潜能、自我更新、低免疫原性以及良好的组织相融性。NSCs是大脑皮质细胞的来源，任何干扰神经干细胞正常增殖、分化或凋亡过程的因素，均可阻碍大脑皮质的正常发育［35］。有资料已经证实，某些嗜中枢的先天性生物致畸因子可引起NSCs的分化或凋亡异常，最终导致中枢神经系统畸形。体外实验发现弓形虫能感染NSCs且可以在细胞内增值，干扰神经球的形成。因而推测弓形虫感染NSCs并干扰其正常的增殖分化或凋亡，可能是其导致中枢神经系统畸形以及功能损伤的另一重要机制之一，而弓形虫对NSCs增殖分化及凋亡影响的分子机制尚待进一步研究。

3 结 语

弓形虫脑炎不仅是先天性弓形虫病的严重类型，也是威胁免疫缺陷或者免疫功能低下人群的致死性疾病。小胶质细胞是构成中枢神经系统免疫保护的重要防线，然而弓形虫感染诱导的某些杀伤性小胶质细胞的活化可导致脑组织的损伤。探索这一重要的免疫病理机制，对于寻求高效安全的药物和疗法具有重要的意义。目前对本病的认识大多是基于动物模型中获得的结果。弓形虫导致的人类中枢神经系统损伤的分子机制尚待深入研究。

［1］Boyer K，Marcinak J，Mc Leod R．Toxopl asma gondii （Toxoplas mosis）［M］．In Principles and Practice of Pediatric Infectious Diseases．3rd ed．New Yor k：Churchill Livingstone，2007．

［2］Mortensen PB，Norgaard－Pedersen B，Waltoft BL，etal．Early infections of Toxopl asma gondii and the later develop ment of schizophrenia［J］．Schizophr Bull，2007，33（3）：741－744．DOI：10．1039／schbul／sb m009

［3］Flegr J，Preiss M，Klose J，etal．Decreased level of psychobiological factor novelty seeking and lower intelligence in men latently infected wit h the protozoan parasite Toxoplasma gondii Dopamine，a missing link bet ween schizophrenia and toxoplasmosis［J］．Biol Psychol，2003，63（3）：253－268．DOI：10．1016／S0301－0511（03）00075－9

［4］Pal mer BS．Meta－analysis of three case controlled studies and an ecological st udy into the link bet ween cryptogenic epilepsy and chronic toxoplasmosis infection［J］．Seizure，2007，16（8）：657－663．DOI：10．1016／j．Seizure．2007．05．010

［5］Sibley LD，Ajioka J W．Population str ucture of Toxoplasma gondii：clonal expansion driven by infrequent recombination and selective sweeps［J］．Annu Rev Microbiol，2008，62：329－351．DOI：10．1146／annurev．Micr o．62．081307．162925

［6］Saeij JP，Coller S，Boyle JP，etal．Toxoplas ma co－opts host gene expression by injection of a poly mor phic kinase ho mologue［J］．Nature，2007，445（7125）：324－327．DOI：10．1038／nat ure05395

［7］Roso wski EE，Lu D，Julien L，etal．Strain－specific activation of the NF－kappaB pathway by GRA15，a novel Toxopl asma gondii dense granule protein［J］．J Exp Med，2011，208（1）：195－212．DOI：10．1084／jem．20100717

［8］Ahn HJ，Ki m S，Nam H W．Nucleolar translocalization of GRA10 of Toxopl asma gondii transfectionally expressed in He－La cells［J］．Korean J Parasitol，2007，45（3）：165－174．DOI：10．3347／kjp．2007．45．3．165

［9］Cottrell AJ．Acquired Toxopl asma encephalitis［J］．Arch Dis Child，1986，6l（1）：84－85．DOI：10．1136／adc．61．1．84

［10］Israelski DM，Remington JS．Toxoplas mosis in non－AIDS i mmunocompromised host［J］．Curr Opin Top Infect Dis，1993，13：322－356．

［11］Zhang BZ，Fu GH，Xue YF，etal．Cerebral toxoplas mosis clin－ical and radiological observation［J］．Chin J Misdiagnostics，2002，2（7）：1035－1036．（in Chinese）张保朝，付国惠，薛永飞．脑弓形虫病临床及影像学观察［J］．中国误诊学杂志，2002，2（7）：1035－1036．

［12］Zhou YH，Fan HJ，Xu YL，etal．Changes of apoptosis and its related pr otein expressions of hippocampal neur ons in rats wit h Toxopl asma gondii chronic infection［J］．Chin J Schisto Contr，2010，22（3）：264－267．（in Chinese）周永华 ，范红结 ，许永良，等．慢性弓形虫感染对大鼠海马神经细胞凋亡周期及caspase3与细胞色素C蛋白表达的影响［J］．中国血吸虫病防治杂志，2010，22（3）：264－267．

［13］Michel T M，Frangou S，Thie meyer D，etal．Evidence for oxidative stress in the frontal cortex in patients wit h recurrent depressive disorder－a post mortem study［J］．Psychiatry Res，2007，151（1／2）：145－150．DOI：10．1016／j．psychres．2006．04．013

［14］Chiarini A，Dal Pra I，Whitfield JF，etal．The killing of neurons by beta－amyloid peptides，prions，and pro－inflammatory cytokines［J］．Ital J Anat Embryol，2006，111（4）：221－246．

［15］Na m YJ，Mani K，Ashton A W，etal．Inhibition of bot h the extrinsic and intrinsic death pathways through nonhomotypic deat h fold interactions［J］．Mol Cell，2004，15（6）：901－912．DOI：10．1016／j．molcel．2004．08．020

［16］Miller G．Neuroscience．The dar k side of glia［J］．Science，2005，308（5723）：778－781．DOI：10．1126／science．308．5723．778

［17］Hickey WF．Basic principles of i mmunological surveillance of the nor mal central ner vous system［J］．Glia，2001，36（2）：118－124．DOI：10．1002／glia．1101

［18］John GR，Lee SC，Br osnan CF．Cytokines：powerf ul regulat ors of glial cell activation［J］．Neur oscientist，2003，9（1）：10－22．DOI：10．1177／1073858402239587

［19］Carson MJ，Sutcliffe JG．Balancing f unction vs self defense：the CNS as an active regulator of i mmune responses［J］．J Neurosci Res，1999，55（1）：1－8．DOI：10．1002／（SICI）1097－4547（19990101）

［20］Medzhit ov R，Janeway C Jr．Innate i mmunity［J］．N Engl J Med，2000，343（5）：338－344．

［21］Strack A，Asensio VC，Campbell IL，etal．Chemokines are differentially expressed by astr ocytes，microglia and infla mmator y leukocytes in Toxopl asma encephalitis and criticallyregulated by interferon－gamma［J］．Acta Neuropathol，2002，103（5）：458－468．DOI：10．1007／s00401－001－0491－7

［22］Suzuki Y，Claflin1 J，Wang X，etal．Microglia and macr ophages as innate producers of interferon－gamma in the brain following infection with Toxopl asma gondii［J］．Int J Parasitol，2005，35（1）：83－90．DOI；10．1016／j．ijpara．2004．10．020

［23］Xie Z，Wei M，Morgan TE，etal．Peroxynitrite mediates neurotoxicity of amyloid beta－peptide1 42－and lipopolysaccharideactivated micr oglia［J］．J Neurosci，2002，22（9）：3484－3492．

［24］Streit WJ，Walter SA，Pennell NA．Reactive microgliosis［J］．Prog Neurobiol，1999，57（6）：563－581．DOI：10．1016／S0301－0082（98）00068－0

［25］Fischer HG，Reichmann G．Brain dendritic cells and macrophages／microglia in central nervous system inflammation［J］．J Immunol，2001，166（4）：2717－2726．

［26］Kreutzberg GW．Microglia：a sensor for pathological events in the CNS［J］．Trends Neurosci，1996，19（8）：312－318．DOI：10．1016／0166－2236（96）10049－7

［27］Li H，Gang Z，Yuling H，etal．Different neurotropic pathogens elicit neurotoxic CCR9－or neurosupportive CXCR3－expressing microglia［J］．J Immunol，2006，177（6）：3644－3656．

［28］Xie Z，Smith CJ，Van Eldik LJ．Activated glia induce neuron death via MAP kinase signaling pathways involving JNK and p38［J］．Glia，2004，45（2）：170－179．DOI：10．1002／glia．10314

［29］Creuzet C，Robert F，Roisin MP，etal．Neurons in primary culture are less efficiently infected by Toxoplasma gondii than glial cells［J］．Parasitol Res，1998，84（1）：25－30．DOI：10．1007／s004360050351

［30］Evans CA，Harbuz MS，Ostenfeld T，etal．Nramp1is expressed in neurons and is associated with behavioural and immune responses to stress［J］．Neurogenetics，2001，3（2）：69－78．DOI：10．1007／s100480100105

［31］Krajewski S，Krajewska M，Shabaik A，etal．Immunohistochemical determination of in vivo distribution of Bax，a dominant inhibitor of Bcl－2［J］．Am J Pathol，1994，145（6）：1323－1336．

［32］Takahashia J，Fukudaa T，Tanaka J，etal．Bax－induced apoptosis not demonstrated in the congenital toxoplasmosis in mice［J］．Brain Dev，2001，23（1）：50－53．DOI：10．1016／S0387－7604（01）00179－6

［33］Schluter D，Lohler J，Deckert M，etal．Toxoplasmaencephalitis of immunocompetent and nude mice：immunohistochemical characterisation of Toxoplasma antigen，infiltrates and major histocompatibility complex gene products［J］．J Neuroimmunol，1991，31（3）：185－198．DOI：10．1016／0165－5728（91）90040－E

［34］Chao CC，Hu S，Molitor TW，etal．Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism［J］．J Immunol，1992，149（8）：2736－2741．

［35］Wang S，Xu ZH．Progress in the study of molecular mechanisms of developmental cortex malformations［J］．Chin J Cell Biol，2011，33（8）：837－846．（in Chinese）王硕，许执恒．大脑皮层发育畸形及分子遗传机理研究进展［J］．中国细胞生物学学报，2011，33（8）：837－846．