吸血蠓分子分类研究进展＊

王飞鹏，黄恩炯，肖 武，宋诚本，王宇平

吸血蠓（Blood－sucking midges）是一类微小型昆虫，属双翅目（Diptera）蠓科（Ceratopogonidae），几乎广泛分布于世界各地，可携带数十种人兽共患病病原，是医学昆虫的重要类群之一。蠓的分类研究最早记载于林奈的《Systema Nat urae》中，距今已有250余年的发展历史，形成了较为成熟的分类体系［1］。但由于蠓科昆虫中存在许多具有多处相似特征的隐种（cr yptic species）组成的复合体（co mplex）或种团（gr oup），沿用传统靠识别形态学特征的方法对这类群昆虫进行分类和鉴定往往较为困难，进而也影响了对其系统进化及其与病原生物关系的深入研究。因此，寻找可靠的分类鉴定方法，以期快速、准确地识别蠓科昆虫，尤其是吸血蠓，是现代昆虫分类学家研究的重要内容之一，也是蠓传疾病防治工作的基础。

分子分类技术是以遗传物质DNA序列分析为依据来阐明物种间的差别，从分子水平上快速而准确地鉴别物种。它是分子生物学、计算机科学与传统分类学相结合的产物，作为一种崭新的分类学技术，极大弥补了传统形态学鉴定的缺陷，已引起越来越多生物学家们的重视。蠓科昆虫的分子分类研究起步较迟，从1992年研究变翅库蠓（Culicoides variipennis）种群的基因差异起［2］，才陆续有报道。近年来，随着以PCR基础的DNA序列测定方法的建立和广泛使用，核糖体DNA（r DNA）的内转录间隔区（ITS）、线粒体 DNA（mt DNA）的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）、细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ（COⅡ）等基因逐渐受到蠓科分类学家们的重视。本文就近几年来吸血蠓的分子分类研究进展综述如下。

1 r DNA内转录间隔区序列的应用

r DNA广泛分布于各种生物细胞中，在功能上具有高度的保守性和良好的时钟性，其测定序列常用于物种分类和生物间系统发育的研究，尤其是物种的种间分类研究［3－5］。目前r DNA作为遗传标记在寄生虫鉴定中的应用日趋广泛，前人对此作了详尽的描述［6－8］。ITS是位于r DNA 上18S和28S基因之间的区域片段，包括ITS1和ITS2两段序列，由于该区域不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较小，进化速度较其他区域快，具有种内变异小而种间变异大的特性，加上协同进化作用保证了该片段在基因组不同单元间的一致性，因而适合进行各种分子操作，是较理想的种间鉴定和系统发育分析的遗传标志［9－12］。近几年来国内外对ITS序列标记在蠓科昆虫中的研究和应用越来越多，r DNA的ITS1和ITS2序列在蠓类昆虫的鉴定中发挥了重要的作用。

1．1 ITS1序列标记 2004年，Cetre－Sossah等［13］通过设计特异性引物，利用ITS1序列标记建立了库蠓属（Culicoides spp．）和残肢库蠓（C．i micol a）的分子分类方法。研究发现：包括残肢库蠓（C．i micol a）在内的9种库蠓的ITS1序列长度范围在316－500 bp，其中，残肢库蠓（C．i micol a）有一条303 bp的特异性条带；之后，Cetre－Sossah等［14］又提出以ITS1作为靶标基因的实时荧光定量PCR技术，该技术特异性强、灵敏度高，在残肢库蠓（C．i micol a）的监测和研究项目上具有广阔的应用前景。Perrin等［15］再次对残肢库蠓（C．i micol a）进行ITS1序列测定和系统发育分析，同源性高达99．8%，验证了ITS1在物种进化和遗传关系研究中的价值。Mathieu等［16］利用PCR技术对不显库蠓复合体（obsolet us co mplex）的ITS1序列进行测定发现：雪翅库蠓（C．chiopter us）、不显库蠓（C．obsoletus）、苏格兰库蠓（C．scoticus）、丘夫库蠓（C．dewul f i）和山丘库蠓（C．montanus）的同源性分别为98．93%、99．43%、98．33%、99．1%和98．47%，对这5种蠓的ITS1片段进行PCR扩增表明，不显库蠓复合体均有一条166 bp的条带，但雪翅库蠓（C．chiopter us），丘夫库蠓（C．dewul f i）和不显库蠓（C．obsoletus）还分别有一条78 bp、117 bp、302 bp的条带，山丘库蠓（C．montanus）还有125 bp和302 bp条带，而苏格兰库蠓（C．scoticus）仅见166 bp这唯一的条带。从遗传关系看，不显库蠓复合体（obsolet us co mplex）中的丘夫库蠓（C．dewul f i）与残肢库蠓（C．i micol a）最为亲近。Stephan［17］采用降落PCR法扩增、克隆丘夫库蠓（C．dewul f i）的ITS1基因。结果表明：丘夫库蠓（C．dewul f i）有一条295 bp的特异性条带，这一结论为丘夫库蠓（C．dewul f i）在不显库蠓复合体中的准确鉴定提供了新的依据。Matsu moto［18］研究提出库蠓的ITS1基因可根据碱基的缺失或插入情况不同分为长型和短型两种类型，并认为长型ITS1是库蠓ITS1基因的原型，一些短型ITS1库蠓是由于碱基缺失所引起，而二囊亚属有其ITS1特异序列，并形成单系群。Li等［19］根据荒川库蠓（C．ar aka wai）、浅色库蠓（C．albicans）、肘臂库蠓（C．cubitalis）等10种库蠓的ITS1基因片段长度，将10种库蠓分为457－469 bp和316－347 bp两群。从总体上看，10种库蠓ITS1片段在288－388 bp的范围出现一个高度保守的区域，由此提出可以在1－287 bp和385－500 bp范围内设计特异性引物，以ITS1为扩增的靶标序列，通过PCR的方法来鉴别各种库蠓。

1．2 ITS2序列标记 Go mulski等［20］对包括灰黑库蠓复合体（pulicaris co mplex）在内的11种库蠓的r DNA－ITS2区基因进行克隆和序列分析，推断意大利主要库蠓亚属的系统发育。结果认为库蠓亚属是由Culicoides sensu stricto，Sil vicol a，Hoff mania Fox和迄今不详的Fagineus复合体4个家系组成的多源聚合体。提出ITS2作为吸血蠓PCR扩增的靶标序列，不仅有利于鉴定蠓新种，还能有效辅助澄清库蠓亚属里的同种异名，分子鉴定与形态学鉴定相佐证能够解决吸血蠓形态学鉴定中的难题。Monaco等［21］提出以ITS2为标记基因的实时荧光定量PCR技术准确率高，比常规PCR更适合运用于不显库蠓复合体（obsolet us co mplex）的快速鉴定，特别是在鉴定大规模不显库蠓复合体（obsolet us co mplex）标本的情况下更具高效性。胡友兰和李国清［22］对荒川库蠓（C．ar aka wai）、变翅库蠓（C．variipennis）和残肢库蠓（C．i micol a）等6种双翅目昆虫r DNA－ITS2的研究表明，双翅目昆虫ITS 2片段大小在不同属间的差异很大，即使是同一属的库蠓，同源性也不高，最大为40．9%［荒川库蠓（C．ar aka wai）与残肢库蠓（C．i micol a）］，荒川库蠓（C．ar aka wai）与变翅库蠓（C．variipennis）的同源性稍低，为32．7%。从而验证了真核生物ITS2序列具有高度变异性的特点，同时也说明了ITS2片段作为库蠓PCR鉴别的靶标序列，能提供比较丰富的遗传信息。

2 线粒体DNA（mt DNA）的应用

线粒体DNA是细胞内相对独立的基因组，具有结构简单、基因组小、易分离纯化、序列顺序和组成一般比较保守、严格遵循母系遗传、单拷贝、进化速率较核DNA快、无重组等特点，它的传递、重组、分离、复制、转录都可应用分子生物学的许多手段和方法进行分析，是分子进化遗传研究领域的热点［23－24］。现已知线粒体的基因组至少含有13个蛋白质基因，其中仅COⅠ、Cyt b、ND4、ND5这4个基因满足基因插入和缺失现象较少、长度在900 bp左右这两个条件，但ND4、ND5进化太快，不可能设计出通用引物，限制了它们作为全面DNA鉴定系统的目标基因［25］。近年来线粒体COⅠ、COⅡ基因在蠓科昆虫分类上的应用较为广泛，尤其是COⅠ基因，在一定程度上可作为传统分类学的补充验证，推动了蠓科昆虫分子分类的研究进展，但Cyt b在蠓的分子分类中至今未见报道。

2．1 细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因 自Hebert等［26－28］提出DNA条形码技术并在全球开展相关的协作研究后，COⅠ基因作为条形码技术的标准目的基因推动了以分子生物学技术为基础的物种鉴定技术，目前已经在脊椎动物和昆虫中得到广泛研究［29－32］。在吸血蠓分子鉴定研究方面，Linton等［33］对残肢库蠓复合体（C．i micol a complex）中5种库蠓的COⅠ基因进行序列测定，结果发现：残肢库蠓复合体（C．i micol a complex）种间差异大，存在显著的A－T碱基颠换。采用邻接法（NJ）和最大简约法（MP）构建系统发育树，分子系统树显示各蠓种间区别明显。Dallas等［34］对残肢库蠓复合体（C．i micol a complex）的CO I基因研究表明，残肢库蠓CO I基因单体型的地理结构与蓝舌病病毒（BTV）的血清型具相关性。Pages and Sarto I Monteys［35］通过设计特异性引物，对CO I基因进行半巢式PCR扩增、克隆，成功鉴定不显库蠓（C．obsoletus）和苏格兰库蠓（C．scoticus）雌虫，并且认为形态学鉴定吸血蠓并不完全可靠，CO I基因可作为吸血蠓种间鉴定的遗传标志。Nolan等［36］也利用基于CO I基因的PCR方法快速准确地鉴定灰黑库蠓复合体（pulicaris co mplex）和不显库蠓复合体（obsolet us co mplex）。Pages等［37］又报道利用条形码技术鉴定识别了库蠓属中的隐存种；同年，Sch wenkenbecher等［38］对不显库蠓复合体［obsolet us co mplex，含丘夫库蠓（C．dewul f i）］与灰黑库蠓复合体（pulicaris co mplex）幼虫的CO I基因进行多重PCR扩增、克隆及序列分析。研究表明CO I基因可作为分子标记用于吸血蠓幼虫的高通量鉴定。幼虫的鉴定结果发现：仅丘夫库蠓（C．dewul f i）在粪堆中有孳生，而其余库蠓幼虫多数孳生于水流或积水湿泥，这对掌握吸血蠓幼虫的生态习性具有重要指导意义。Augot等［39］利用基于CO I基因的条形码技术，同时结合对头部、生殖器和胸部的形态测量，成功鉴定了88份不显库蠓（C．obsoletus）和苏格兰库蠓（C．scoticus）雌虫标本。但是，利用基于CO I基因的DNA条形码技术鉴定吸血蠓在我国至今未见报道。

2．2 细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ（COⅡ）基因 COⅡ序列具有很高的趋异性，尤其是在一些双翅目和膜翅目昆虫中，COⅡ基因序列和氨基酸顺序均表现出高度的趋异性［40］，因此，COⅡ基因序列在这类昆虫的进化机制及系统发育研究方面是一种非常有效的分子标记。通过分析台湾地区台湾蠛蠓（Lasiohelea tai wana）的COⅡ基因序列发现：不同台湾蠛蠓（La．tai wana）个体间核苷酸分化程度可高达2．7%。群体内以及群体间的平均变异水平在0．7% 左右。因此，遗传交流可能是导致如今台湾地区台湾蠛蠓（La．tai wana）种群组成多元化的原因［41］。对蚊科、蠓科、摇蚊科以及蚋科等昆虫的COII序列分析表明蠓群体间的分化程度较大，其在所属的科中属于较古老的种，而且相对于其他双翅目长角亚目昆虫具有更为显著的序列进化［42］。

3 结 语

寻求快速、准确、可靠的吸血蠓种类鉴定技术，不仅是口岸一线检疫工作人员开展检疫工作和有效防制蠓传疾病的重要基础，更是生物学家发现新种和隐存种，重建物种和高级阶元的演化关系，丰富生物资源的有效途径。虽然分子分类与鉴定技术兴起时间较晚，但其正以稳步、快速的态势发展。吸血蠓分子水平上的研究不仅有助于准确地分类鉴定，也将有利于对其媒介功能的研究。目前，分子生物学技术已多见于吸血蠓种团、复合体的分类鉴别中，少数也涉及到种群分化的研究，这将为解决蠓科研究中存有争议的问题提供指导性资料。当今，国内外学者对吸血蠓的分子分类已做了大量研究工作，但都仍处于实验室研究阶段，各种分子分类应用的靶标基因有优点也存在其一定的局限性。核糖体DNA上的ITS区域序列进化速度快，在物种水平上变异较大，序列多态性强并含有足够量的遗传信息，已被广泛用于物种分类及系统进化研究，但是这些基因中存在大量的插入和缺失现象，从而使序列比对受到障碍，不便操作，而且还容易造成错误的比对［43］。基于线粒体基因编码的DNA条形码技术及其应用前景虽被众多学者所看好，但也有学者认为如此短的DNA片段不能提供物种水平的可靠信息，完全依靠 DNA 条形码会导致鉴定错误［44－45］。更有人认为采用DNA条形码技术将是一种倒退，会将分类学退回到类型学［46－47］。在利用任何一个基因或多个基因片段进行物种分类和种属鉴定时，不能只考虑所选用标记基因的片段长度，而应该结合序列组成及其同源性综合评价。例如，Sch wenkenbecher［48］选用ITS1、ITS2和 COⅠ3个靶标基因通过系统发育分析提出了丘夫库蠓（C．dewul f i）不应属于不显库蠓复合体的观点。鉴于此，分子分类技术依旧无法完全取代传统的吸血蠓分类鉴定方法，传统的形态学手段不能完全抛弃。

总之，分子分类技术目前所表现出的局限性不应是其应用和发展的阻碍，对于其面临的问题，可以探索、尝试新的分子标记及多个分子标记相结合使用来解决，同时也不排斥其他分类方法，包括生物化学、计算机数值分类学和细胞遗传学等方法，多层次、多方面、系统地研究吸血蠓分类，这样就更能反映吸血蠓的种群进化和亲缘关系。今后，随着分子生物学的不断发展，吸血蠓的分子分类技术也将不断地进步和成熟。充分发挥分子分类技术的独特优势，利用分子分类技术与传统的分类方法相互佐证，将大大有助于吸血蠓的分类鉴定。

［1］Yu YX．Ceratopogonidae of China［M］．Beijing：Press of Military Medical Sciences．2006：3－4．（in Chinese）虞以新．中国蠓科昆虫［M］．北京：军事医学科学出版社．2006，3－4．

［2］Tabachnick WJ．Genetic differentiation a mong populations of Culicoides variipennis （Diptera：Ceratopogonidae），the North American vector of bluet ongue vir us［J］．Ann Ento mol Soc Am，1992，85（2）：140－147．

［3］Dover G．Molecular drive：a cohesive mode of species evol ution［J］． Nature，1982，299 （5879） ：111－117．DOI：10．1038／299111a0

［4］Hillis DM，Davis SK．Riboso mal DNA：intraspecific poly morphism，concerted evolution and phylogeny reconstruction ［J］．Syst Zool，1988，37（1）：63－66．DOI：10．2307／2413191

［5］Hillis DM，Dixon MT．Riboso mal DNA：molecular evol ution and phylogenetic inference［J］．Q Rev Biol，1991，66（4）：411－453．DOI：10．1086／417338

［6］Gajahar AA，Marquardt WC，Hall R，etal．Ribosomal RNA sequence of Sarcocystis muris，Theileria annul ata and Cr ypthecodiniu m cohnii reveal evol utionary relationship among apico mlexan，dinoflagellates and ciliates ［J］．Mol Biochem Parasitol，1991，45（1）：147－154．DOI：10．1016／0166－6851（91）90036－6

［7］Ellis J，Hefford C，Baverstock PR，etal．Ribosomal DNA sequence comparison of Babesia and Theileria ［J］．Mol Biochem Parasitol，1992，54（1）：97－96．DOI：10．1016／0166－6851（92）90097－4

［8］Allsopp MT，Cavalier－Smith T，De Waal DT，etal．Phylogeny and evolution of the piroplas ms［J］．Parasitology，1994，108：147－152．DOI：10．1017／S0031182000068232

［9］Paskewitz SM，Wesson DM，Collins FH．The inter nal transcribed spacers of riboso mal DNA in five members of the Anopheles ga mbiae species co mplex［J］．Insect Mol Biol，1993，2（4）：247－257．DOI：10．1111／j．1365－2583

［10］Kuhls K，Mauricio IL，Pratlong F，etal．Analysis of riboso mal DNA inter nal transcribed spacer sequences of the Leish mania donovani co mplex ［J］．Microbes Infect，2005，7 （11／12）：1224－1234．DOI：10．1016／j－micinf．2005．04．009

［11］Niu QL，Luo JX，Yin H．Advances and application of r DNAITS in the molecular taxonomy of parasite［J］．Chin J Vet Parasitol，2008，16（4）：41－47．（in Chinese）牛庆丽，罗建勋，殷宏．转录间隔区（ITS）在寄生虫分子生物学分类中的应用及其进展［J］．中国兽医寄生虫病，2008，16（4）：41－47．

［12］Li XJ，Yang YM．Application of ribosomal DNA internal transcribed spacer in parasites［J］．J Dali Univ，2008，7 （4）：79－81．（in Chinese）李晓娟，杨毅梅．核糖体DNA内转录间隔区序列标记在寄生虫学中的应用［J］．大理学院学报，2008，7（4）：79－81．

［13］Cetre－Sossah C，Baldet T，Delecolle JC，etal．Molecular detection of Culicoides spp．and Culicoides i micol a，the principal vector of bluet ongue（BT）and African horse sickness（AHS）in Africa and Europe［J］．Vet Res，2004，35（3）：325－337．DOI：10．1051／vetres：2004015

［14］Cetre－Sossah C，Mat hieu B，Setier－Rio ML，etal．Develop ment and evaluation of a real－ti me quantitative PCR assay for Culicoides i micola，one of the main vectors of bluetongue（BT）and African horse sickness（AHS）in Africa and Europe［J］．Res Vet Sci，2008，85（2）：372－382．DOI：10．1016／j．rvsc．2007．12．001

［15］Perrin A，Cetre－Sossah C，Mat hieu B，etal．Phylogenetic analysis of Culicoides species from France based on nuclear ITS1－r DNA sequences［J］．Med Vet Ento mol，2006，20（2）：219－228．DOI：10．1111／j．1365－2915．2006．00616．x

［16］Mat hieu B，Perrin A，Baldet T，etal．Molecular identification of wester n Eur opean species of Obsolet us co mplex （Diptera：Ceratopogonidae）by an internal transcribed spacer－1 r DNA multiplex poly merase chain reaction assay［J］．J Med Ento mol，2007，44（6）：1019－1025．DOI：10．1603／0022－2585（2007）44［1019：MIOWES］2．0．CO；2

［17］Stephan A，Clausen PH，Bauer B，etal．PCR identification of Culicoides dewul f i midges（Diptera：Ceratopogonidae），potential vectors of bluetongue in Ger many［J］．Parasitol Res，2009，105（2）：367－371．DOI：10．1007／s00436－009－1407－z

［18］Matsu moto Y，Yanase T，Tsuda T，etal．Charceterization of inter nal transcribed spacer （ITS1）－ITS2 region of riboso mal RNA gene from 25 species of Culicoides biting midges（Diptera：Ceratopogonidae）in Japan［J］．J Med Entomol，2009，46（5）：1099－1108．DOI：10．1603／033．046．0517

［19］Li GQ，Hu YL，Kanu S，etal．PCR amplification and sequencing of ITS1 r DNA of Culicoides ar akawai［J］．Vet Parasitol，2003，112（1－2）：101－108．

［20］Gomulski L M，Meiswinkel R，Delecolle JC，etal．Phylogeny of the subgenus Culicoides and related species in Italy，inferred from inter nal transcribed spacer 2 riboso mal DNA sequences［J］．Med Vet Ento mol，2006，20（2）：229－238．DOI：10．1111／j．1365－2915．2006．00620．x

［21］Monaco F，Benedetto L，Marcello VD，etal．Develop ment and preli minary evaluation of a real－ti me poly merase chain reaction for the identification of Cuilcoides obsolet us sensu strict u，C．scoticus and C．montanus in the Obsoletus Co mplex in Italy［J］．Vet Ital，2010，46（2）：215－220．

［22］Hu YL，Li GQ．Sequencing and analysis of ITS2 r DNA sequences of the midge（Culicoides arakawae）［J］．Acta Zoological Sinica，2003，49（2）：277－280．（in Chinese）胡友兰，李国清．荒川库蠓r DNA ITS2的序列测定与分析［J］．动物学报，2003，49（2）：277－280．

［23］Wang TC，Liu CL，Xiao LZ．Research Progression in mt DNA［J］．J Anhui Agri Sci，2006，34（10）：2068，2071．（in Chinese）汪泰初，刘朝良，肖林珍．线粒体基因组（mt DNA）的研究进展［J］．安徽农业科学，2006，34（10）：2068，2071．

［24］Gray M．Origin and evol ution of mit ochondrial DNA［J］．Ann Rev Cell Biol，1989，5：25－50．DOI：10．1146／annurev．cb．05．110189．000325

［25］Ma Y，Research on identification of s mall mammals and parasitic fleas by DNA barcoding in Qinghai Province，China［D］．Beijing：Chinese Center for Disease and Prevention of China，2010：1－10．（in Chinese）马英．DNA条形码技术在青海省小型兽类及寄生蚤鉴定中的应用研究［D］．中国疾病预防控制中心．2010．

［26］Heber PD，Cy winska A，Bali SL，etal．Biological identifica－tions t hr ough DNA barcodes［J］．Proc Biol Sci，2003，270（1512）：313－321．DOI：10．1098／rspb．2002．2218

［27］Hebert PD，Ratnasingham S，de Waard JR．Barcoding animal life：cytochr o me coxidase subunit 1 divergences a mong closely related species［J］．Proc Biol Sci，2003，270：S96－S99．DOI：10．1098／rsbl．2003．0025

［28］Hebert PD，Penton EH，Bur ns JM，etal．Ten species in one：DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astr aptes f ul ger ator［J］．Pr oc Natl Acad Sci U S A，2004， 101 （41 ）： 14812－14817． DOI： 10． 1073／pnas．0406166101

［29］Li LZ，Huang ZX．Pr ogresses in cytochr o me C oxidase studies［J］．J Inorg Chem，2001，17（6）：761－774．（in Chinese）李连之，黄仲贤．细胞色素C氧化酶研究新进展［J］．无机化学学报，2001，17（6）：761－774．

［30］Bai GR，Lu SM．The progress of the mitochondrial DNA encoding cytochr o me oxidase subunit gene［J］．Foreign Med Sci Sect Med Mol Biol，2003，25（6）：354－357．（in Chinese）柏干荣，陆松敏．线粒体DNA编码细胞色素氧化酶亚基基因的进展［J］．国外医学 （分子生物学分册），2003，25（6）：354－357．

［31］Skelly PJ，Stein LD，Shoemaker CB．Expression of Schistosoma mansoni genes involved in anaer obic and oxidative glucose metabolism during the cercaria to adult transfor mation［J］．Mol Biochem Parasit ol，1993，60（1）：93－104．DOI：10．1016／0166－6851（93）90032－S

［32］Magzoub M，Maegrait h BG，Fletcher KA．The oxidative metabolis m of Schistoso ma mansoni and the effects of antischistoso mal dr ugs and cytochr o me oxidase inhibit ors［J］．Ann Trop Med Parasitol，l971，65（1）：31－44．

［33］Linton Y M，Mor due AJ，Cr uickshank RH，etal．Phylogentic analysis of the mitochondrial cytochr o me oxidase subunit I gene of five species of the Culicoides i micola species co mplex ［J］．Med Vet Entomol，2002，16（2）：139－146．DOI：10．1046／j．1365－2915．2002．00356．x

［34］Dallas JF，Cr uickshank RH，Linton Y M，etal．Phylogenetic status and matrilineal structure of the biting midge，Culicoides i micol a，in Port ugal，Rhodes and Israel［J］．Med Vet Ento mol，2003，17（4）：379－387．

［35］Pages N，Sarto I，Monteys V．Differentiation of Culicoides obsoletus and Culicoides scoticus （Diptera：Ceratopogonidae）based on mitochondrial cytochrome oxidase subunit I ［J］．J Med Entomol，2005，42（6）：1026－1034．DOI：10．1603／0022－2585（2005）042［1026：DOCOAC］2．0．CO；2

［36］Nolan DV，Carpenter S，Barber J，etal．Rapid diagnostic PCR assays for members of the Culicoides obsoletus and Culicoides pulicaris species co mplexes，i mplicated vectors of bluetongue virus in Europe［J］．Vet Microbiol，2007，124（1／2）：82－94．DOI：10．1016／j．vet mic．2007．03．019

［37］Pages N，Munoz－Munoz F，Talavera S，etal．Identification of cr yptic species of Culicoides（Diptera：Ceratopogonidae）in the subgenus Culicoides and develop ment of species－specific PCR assays based on barcode regions［J］．Vet Parasit ol，2009，165（3／4）：298－310．DOI：10．1016／j．vet par．2009．07．020

［38］Sch wenkenbecher JM，Mordue AJ，Switek K，etal．Discri mination of Culicoides midge lar vae using multiplex poly merase chain reaction assays based on DNA sequence variation at the mitochondrial cytochro me C oxidase I gene ［J］．J Med Entomol，2009，46（3）：610－614．DOI：10．1603／033．046．0328

［39］Augot D，Sauvage F，Jouet D，etal．Discri mination of Culicoides obsoletus and Culicoides scoticus，potential bluetongue vectors，by mor pho metrical and mitochondrial cytochr o me oxidase subunit I analysis［J］．Infect Genet Evol，2010，10 （5）：629－637．DOI：10．1016／j．meegid．2010．03．016

［40］Liu H，Beckenbach A．Evolution of the mit ochondrial cytochr o me oxidase Ⅱ gene a mong 10 orders of insects［J］．Mol Phylogenet Evol，1992，1（1）：41－52．

［41］Yeh WB，Lee H M，Tu WC，etal．Molecular differentiation and diversity of Forcipomyia tai wana （Diptera：Cerat opogonidae）based on the mitochondrial cytochr o me oxidaseⅡsequence［J］．J Med Ento mol，2009，46（2）：249－256．DOI：10．1603／033．046．0209

［42］Beckenbach AT，Bor kent A．Molecular analysis of the biting midges（Diptera：Ceratopogonidae），based on mitochondrial cytochr o me oxidase subunit 2［J］．Mol Phylogenet Evol，2003，27（1）：21－35．DOI：10．1016／S1055－7903（02）00395－0

［43］Liu Y，Song Y，Li XY．Application of DNA barcoding based on mit ochondrial cytochr o me C oxidase I gene in molecular identification of insects［J］．Plant Quarantine，2010，24（2）：46－50．（in Chinese）刘勇，宋毓，李晓宇．基于线粒体CO I基因的DNA条形码技术在昆虫分子鉴定中的应用［J］．植物检疫，2010，24（2）：46－50．

［44］Will K W，Rubinoff D．Myt h of the molecule：DNA barcodes for species cannot replace mor phology for identification and classification［J］．Cladistics，2004，20（1）：47－55．DOI：10．1111／j．1096－0031．2003．00008．x

［45］Ebach MC，Holdrege C．DNA barcoding is no substitute for taxono my［J］．Nature，2005，434（7034）：697．DOI：10．1038／434697b

［46］Mallet J，Will mott K．Taxono my：renaissance or Tower of Babel［J］．Trends Ecol Evol，2003，18（2）：57－59．DOI：10．1016／S0169－5347（02）00061－7

［47］Will K W，Mishler BD，Wheeler QD．The perils of DNA barcoding and the need for integrative taxono my［J］．Syst Biol．2005，54（5）：844－851．DOI：10．1016／S0169－5347（02）00061－7

［48］Sch wenkenbecher JM，Mor due AJ，Piertney SB．Phylogenetic analysis indicates that Culicoides dewul f i should not be considered part of the Culicoides obsolet us co mplex［J］．Bull Ento mol Res，2009，99（4）：371－375．DOI：10．1017／S0007485308006391