顶复门原虫诱导宿主micro RNAs变化的研究进展

范艺凡，周东辉，徐民俊，李成琳，朱兴全，蒋文灿

顶复门（Apicomplexan）寄生虫包括多种专性寄生于细胞内的原虫，有一些不仅严重危害人类和动物的健康，而且还给全球畜牧业造成巨大的经济损失。其中，疟原虫（Pl asmodium）、隐孢子虫（Cr y ptosporidiu m par vu m）、弓形虫（Toxopl asma gondii）等危害比较严重［1］。为了保证在细胞内生存，顶复门原虫能精确地识别有利于它们发育的宿主细胞，并向宿主细胞内分泌一些蛋白质，从而干扰宿主信号通路（例如细胞凋亡，细胞因子的产生），改变宿主的防御性能［2－4］。虽然已有研究证明顶复门原虫能改变宿主细胞环境，但具体改变的分子机制仍然不清楚。最近，顶复门原虫诱导宿主micro RNAs（mi RNAs）表达水平变化的发现也许将为研究寄生虫如何改变宿主体内环境的分子机制提供新的线索［5－9］。

mi RNAs是一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，它们通过与靶mRNAs的完全或不完全结合来降解或抑制靶m RNAs的翻译，对动物和植物转录后基因的表达调控起着重要的作用［10］。mi RNAs约占人类总基因的0．5%～1．5%，却调控大约30%的基因转录，mi RNAs的靶基因分布广泛，每个成熟的mi RNA可以抑制几十甚至数百个靶mRNAs的表达，调控细胞生长、凋亡、发育、代谢、基因转录、翻译和免疫反应等［11－14］。

1 顶复门原虫改变宿主体内环境

1．1 Toll－like受 体 与 免 疫 应 答 Toll－like受 体（TLRs）是一类识别病原微生物的重要蛋白质。通过对弓形虫、伯氏疟原虫（Pl asmodiu m ber ghei）、克氏锥虫（Tr y panosoma cr uzi）等的研究，发现 TLRs参与了宿主对入侵顶复门原虫的识别［15－17］。弓形虫感染宿主后，宿主通过依赖骨髓分化蛋白88（My D88）的 TLRs途径促进IFN－r的产生，因此TLRs途 径 对 宿 主 抵 抗 弓 形 虫 感 染 很 重 要［18－19］。TLRs受体激活一系列转换蛋白（例如 My D88）最终导致一系列包括核因子（NF－k B），Janus激酶（JAK）和信号转导及转录激活因子（STAT）信号途径的激活。信号途径的激活促使一系列宿主细胞抗病原蛋白转录的激活，然后产生抗微生物分子（例如促炎细胞因子、趋化因子和IL－12），最终将增强非特异性免疫［20－22］。为了维持免疫应答平衡，上皮细胞对TLRs受体免疫信号通路进行了负馈调控。例如，细胞因子诱导的Src同源2蛋白（CIS）和细胞因子信号抑制物4（SOCS）将使致炎症因子的产生得到明显的抑制。最有代表性的SOCS家族成员是CIS和SOCSI－3蛋白质，它们通过干扰JAK／STAT信号途径来抑制细胞因子的产生。因此，在感染顶复门原虫的机体中，识别病原的TLRs受体能诱导CIS／SOCS的表达和调控细胞因子受体的信号通路［23－26］。

1．2 向宿主细胞内分泌蛋白质 当寄生虫侵入宿主细胞后，会分泌一些能改变宿主细胞环境的效应分子，例如：弓形虫利用棒状体和致密颗粒分泌细胞器向宿主细胞注入一些有效因子。这些因子能帮助弓形虫适应宿主细胞环境，其中包括：①有助于弓形虫侵入宿主细胞的棒状体蛋白ROP16，它磷酸化STAT3和STAT6，从而降低白介素（IL－6，IL－2）的产生［27－28］。②ROP18磷酸化宿主细胞免疫相关的GTP酶，干涉细胞抵抗外来微生物入侵的途径［29－30］。③GRA15，它是一种致密颗粒蛋白，激活宿主转录因子NF－k B［31］。④还有一种进入宿主细胞核，但仍不清楚功能的蛋白磷酸化酶2C［32］。⑤UIS3是疟原虫在纳虫空泡膜内分泌的一种蛋白质，它结合肝脏脂肪酸结合蛋白（L－FABP）帮助疟原虫摄取宿主的脂肪酸［33］。⑥泰勒虫分泌一些蛋白质同AT－hook DNA结合基序连接，它们从寄生虫转运到宿主细胞核从而改变宿主基因表达［34］。⑦弓形虫分泌的亲环蛋白－18（C－18）能刺激宿主通过TLRs受体通路产生IL－12［35］。因此，寄生虫能分泌一些特异的效应分子调控宿主细胞转录因子（例如，STAT3和 NF－k B）。所以，有研究者推测这些寄生虫分泌蛋白有助于改变宿主mi RNAs，从而重塑宿主体内环境。

2 顶复门原虫改变宿主mi RNAs的表达

mi RNAs在哺乳动物体内的地位很重要，是免疫反应的重要调控因子。因此，一些mi RNAs参与特异性免疫和非特异性免疫（例如，炎症细胞因子的产生，单核细胞和嗜中性粒细胞的增值，T细胞和B细胞的分化）。它们如同一道安全阀门抵抗外来基因在机体内表达，mi RNAs基因调控的失调将引发很多疾病（例如：癌症）。哺乳动物细胞内的mi R－NAs通过与病毒（例如水泡性口炎病毒、泡沫病毒、艾滋病毒）直接结合而清除它们［36－38］。拟南芥的mi R－393通过抑制生长素信号途径来抵抗细胞外病原假单胞菌的入侵，与此同时，细胞外病原假单胞菌也分泌一些蛋白质来抵抗小RNA介导的宿主免疫反应［39－40］。由于病毒，细菌能改变被感染机体 mi RNAs的表达量，一些研究者开始研究顶复门寄生虫是否也通过影响宿主mi RNAs的表达量，最终诱导宿主细胞环境的改变。

2．1 弓形虫 研究者发现弓形虫感染宿主细胞后，将显著改变宿主细胞mi RNAs表达。例如：Zeiner等发现人包皮成纤维细胞的mi R－17～92和mi R－106b～25随着细胞感染弓形虫后表达量将大量增加。然而，当人包皮成纤维细胞感染犬新孢子虫（Neospor a caninu m）后，mi R－17 家 族 mi RNAs的表达量却没有改变。不同的顶复门原虫对宿主细胞mi R－17家族mi RNAs表达量的不同影响，表明不同的顶复门原虫能够用自己独特的方式改变宿主一些mi RNAs的表达［9］。后来Zeiner等又用一系列引物延伸实验进一步证明了人包皮成纤维细胞在感染弓形虫后，mi R－17家族 mi RNAs将显著增加［41］。另外，已有研究表明，mi R－17～92能诱导髓样细胞增殖和分化，从而参与机体抵御病原体早期免疫应答反应的调节［42］。由此可见，弓形虫在感染宿主后，能引起宿主某些mi RNAs表达的改变，从而引起宿主的急性免疫应答反应。

2．2 隐孢子虫 Let－7家族mi RNAs能在人类胆管上皮细胞内表达，感染了隐孢子虫的人类胆管上皮细胞将导致pri－Let－7i和成熟Let－7表达量的降低，Let－7表达量的降低伴随TLR4表达量的上调。在感染了隐孢子虫的细胞中，Let－7与TLR4蛋白质表达量呈负相关的变化说明了mi RNAs介导的转录后调控途径对顶复门原虫感染的宿主细胞的基因调控很重要［5］。也有研究者发现，隐孢子虫感染宿主后，将降低宿主 mi R－98和let－7的表达量，mi R－98或let－7与SOCS4的3末端非翻译区结合将抑制SOCS4的翻译，最终促进细胞因子诱导的Src同源2蛋白（CIS）和细胞因子信号抑制物4（SOCS）的表达。CIS和SOCS蛋白质通过干扰JAK／STAT信号途径来抑制细胞因子的产生［8］。以上数据充分表明宿主在感染隐孢子虫后，会显著改变与调控TLR信号途径相关mi RNAs的表达量。这表明，依赖mi RNAs为基础的调控途径将有助于宿主防御反应的产生。另外，隐孢子虫还能降低胆管上皮细胞mi R－513表达水平，而且mi R－513能调控B7－H1蛋白［7］。

2．3 疟原虫 感染了夏氏疟原虫（Pl asmodiu m chabaudi mal aria）的肝脏细胞，将促进编码IL－1β，TNF－α，IFN－γ，NF－κ和i NOS蛋白的 m RNAs表达，而这些因子涉及天然免疫，并且调控宿主感染病原后的免疫反应；同时降低CYP7 A1和SULT2 A2蛋白m RNA的表达，而这两个蛋白与肝脏新陈代谢有关。另外，肝脏细胞的 mi R－26b，MCMV－mi RM23－1－5p，mi R－1274a表达量增加的同时降低了mi R－101b，let－7a，let－7g，mi R－193a－3p，mi R－192，mi R－142－5p，mi R－465d，mi R－677，mi R－98，mi R－694，mi R－374＊，mi R－450b－5p，mi R－464，mi R－377，mi R－20a＊ 和 mi R－466d－3p的表达量［43］。然而感染了疟原虫的肝脏，却没引起mi R－21的表达变化，而有研究者发现这个mi RNA涉及肝细胞的分化［44］。这些免疫因子和mi RNAs的动态变化证明宿主保护性免疫反应的产生结合了不同种类mi RNAs表达的重塑。冈比亚按蚊（Anopheles ga mbiae）感 染 疟 原 虫 后，Aga－mi R－34，aga－mi R－1174和 aga－mi R－1175表达量将降低，然而 agami R－989的表达量却显著升高。阻断Dicer1和Ago1的mRNAs表达后将加强疟原虫感染冈比亚按蚊，说明这些mi RNAs调控冈比亚按蚊的免疫应答［45］。由于隐孢子虫和疟原虫感染不同种类的宿主或宿主细胞后，都将降低let－7家族mi RNAs的表达量，表明let－7在宿主感染寄生虫后起重要作用。

3 展 望

随着mi RNAs相关技术的日趋成熟，关于顶复门原虫诱导宿主mi RNAs表达变化的研究将会越来越多。然而，一个关键性问题有待解决：顶复门原虫感染宿主后，宿主mi RNAs的重塑是因为原虫干扰了宿主mi RNAs通路，还是宿主对病原的一个普遍免疫应答反应？事实上，犬新孢子虫和弓形虫对宿主细胞mi R－17家族mi RNAs表达量的差异性影响［9］，表明顶复门原虫对宿主mi RNAs的改变不只是由宿主的免疫应答反应引起。这些独特的方式会是像病毒一样通过自己的脱氧核苷酸改变宿主mi RNAs吗［46］？有研究者推测弓形虫通过分泌自己的mi RNAs来击破宿主细胞mi RNAs防御途径。弓形虫能产生一系列包括mi RNAs在内的内源性小RNA，然而一些原虫却没有mi RNA调控机制，例如：隐孢子虫、疟原虫［47］。那么，不能产生mi RNAs的顶复门原虫又是怎样改变宿主mi RNAs的呢？也许，顶复门原虫通过分泌到宿主细胞的蛋白质来改变宿主mi RNAs。当然，宿主mi RNAs的改变也可能由依赖识别病原的TLRs受体通路引起的。宿主外在的病原影响因子和自身的免疫应答都可能改变宿主mi RNAs表达，从而重塑体内环境。进一步研究顶复门原虫分泌到宿主细胞的蛋白质和宿主mi RNAs之间的关系，或许将拓宽我们对顶复门原虫与宿主相互影响分子机制的认识。

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