牙髓干细胞在再生医学中的研究进展

郑 伟 刘朋飞 冯业童 董 超 周余来 (通化市口腔医院，吉林 通化 34000)

干细胞是一类具有自我复制能力和一定分化潜能的细胞，在一定条件下，它可以分化成多种具有不同功能的细胞。根据干细胞所处的发育阶段及其功能学特性，可将其进一步分为胚胎干细胞和成体干细胞。因此，干细胞在组织工程、再生医学中有着重要的应用价值。目前，牙齿缺损等牙源性疾病在中老年人中发病率较高。牙髓干细胞(dental pulp stem cell，DPSC)是牙髓组织中的一类成体干细胞，具有一定的分化潜能和增殖能力，在牙齿再生、牙髓修复方面有着重要的应用价值，特别是随着相关组织工程技术的发展，DPSC具备了成为一种新型种子细胞的潜能〔1〕。

1 DPSC的定义和基本生物学性质

成牙本质细胞是一种终末细胞，不具备进一步分化的能力，因此，一般认为成牙本质细胞在遭受损伤后，牙髓内的某些具有分化功能的前体细胞可进一步分化为成牙本质细胞，并分泌相关细胞基质，修复受损组织，这种前体细胞即为DPSC。DPSC具有较强的增殖能力和较高的分化潜能，正是这两种生物学性质，决定了DPSC在牙源组织修复和骨性修复方面具有重要的作用〔2〕。

Gronthos等〔3〕在2000年首次正式提出了DPSC的概念，把牙髓内可以快速增殖并且具有一定克隆形成能力的牙髓细胞命名为DPSC，研究人员应用酶消化法对成人第三磨牙的牙髓细胞进行培养，并与骨髓间充质干细胞进行比较，结果显示：这两种细胞具有极为相似的免疫学特性，并且，该研究进一步证实DPSC经体外诱导后，可形成高密度的钙化小结，将DPSC与羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)支架复合后移植到小鼠背侧皮下，经过一段时间后，能观察到类似于牙本质-牙髓复合体样的结构。

2 DPSC的多向分化潜能

作为一种成体干细胞，DPSC具备多向分化的潜能，这种潜能不仅仅局限在骨性分化方面，研究人员在成脂分化、神经分化等方面均取得了一定的研究成果，在再生医学研究领域有着重要的指导意义。

2.1 DPSC的骨性分化 DPSC的骨性分化是关于DPSC定向分化研究较早的一项内容，近些年来，又有了进一步的发展。Mori等〔4〕采用成骨分化培养基进行对DPSC的骨性诱导分化，结果发现，某些典型成骨细胞基因，如：碱性磷酸酶、I型胶原、骨桥蛋白等均大量表达;应用微阵列及RT-PCR技术进一步研究发现，在成骨分化过程中，胰岛素样生长因子结合蛋白5基因(IGFBP-5)、JunB原癌基因(JUNB)和核受体相关基因(NURR1)均发生表达上调现象，这一机制在成骨分化过程中有着重要的意义。D'Alimonte等〔5〕在人源DPSC正常成骨诱导过程中，加入血管内皮生长因子，结果显示：这种方法可以刺激DPSC的增殖分裂的速度加快，而且促进了成骨分化的进程。

2.2 DPSC的神经分化 DPSC来源于胚胎时期的神经脊，在神经分化方面具备一定的潜能。Király等〔6〕采用低温损伤的方法制备3日龄Wistar大鼠脑缺损模型，于颅内注入DPSC进行修复，研究发现：DPSC趋向分布于室下区、胼胝体下区等神经系统祖细胞区，并表达微管蛋白(N-tubulin)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)等神经细胞标志，对损伤部位有一定的修复作用，并且具有神经系统相关细胞的电压依从性。因此，该结果进一步显示，DPSC在脑损伤体内修复方面，可以作为一种有效的修复细胞。Karaöz等〔7〕研究表明：DPSC不仅可以分化为神经干细胞，而且在分化能力方面，高于传统的骨髓间充质干细胞。

2.3 DPSC的成脂分化 除成骨分化、神经分化方面，成脂分化也是DPSC的一项重要潜能。Nozaki等〔8〕于成脂培养基中加入胰岛素、地塞米松等诱导成脂，经过一段时间的作用，可见细胞中有脂滴的形成，并且在分化过程中多能性标记转录因子(Oct3/4、Sox2)均呈现下调趋势，Nanog基因无显著变化;通过基因微阵列分析，研究人员进一步发现：过氧化物酶体增生物激活受体信号通路的多种组分，均发生变化。所以，对这些基因的调控，在细胞成脂分化过程中有着重要意义。

3 DPSC的分化诱导因素

在细胞分化的过程中，分化方向、分化程度、分化速度均会受到一系列物化因素、生物因素的影响，协调各方面因素对控制细胞定向分化有着重要意义。Ito等〔9〕将犬类的DPSC与不同的支架材料相结合，并用这种结合物治疗骨缺损，结果发现不同的支架材料，修复效果会有较大差异，其中DPSC/富血小板血浆(PRP)复合物具备较好的修复效果。Galler等〔10〕将DPSC接种于水凝胶支架上，并将复合物移植到经过次氯酸钠(NaClO)、乙二胺四乙酸(EDTA)处理过的牙本质内部，培养6 w后，发现经NaClO处理的牙本质与复合物结合较好，接触面形成大量细胞陷窝;经乙二胺四乙酸(EDTA)处理的牙本质可以诱导进一步DPSC向成牙质细胞分化，进一步表达牙本质涎蛋白，提高牙本质的修复速度。Yang等〔11〕以大鼠DPSC为研究对象，在常规成骨分化培养基中添加白细胞介素β(IL-1β)，结果显示，细胞的骨唾液蛋白、牙本质基质蛋白等矿化物质的表达均上调，体内实验也得到了相似结果，可见，IL-1β在成骨矿化过程中有一定的促进作用。骨形态发生蛋白在诱导成骨方面有着重要作用，Liu等〔12〕分离扩增家兔DPSC后，将这种种子细胞接种在羟基磷灰石、胶原等支架材料上，并用骨形态发生蛋白II进行刺激处理，结果成骨速度明显提高，最后制备的复合物更有利于体内移植和组织修复。

4 DPSC的重编程与再分化

2006 年，Takahashi等〔13〕将4 个转录因子(Oct4，Sox2，cMyc和Klf4)导入已处于终末分化状态的小鼠成纤维细胞中，从而获得了一种类似于胚胎干细胞的多能性细胞，称为“诱导性多能干细胞”(induced pluripotent stem cells，iPS cells)。这种方法可以非常稳定的制造多能干细胞，引起了极大的关注。继此之后，人类体细胞被成功诱导为iPS的报道〔14〕和老年人皮肤成纤维细胞被诱导为iPS细胞亚群的报道〔15〕相继出现，这种细胞被认为是一种极具前景的干细胞。体细胞通过一定诱导方式，转变为iPS细胞亚群的过程称为“重编程”;iPS经过定向诱导，再次分化为其他种类细胞的过程，称为“再分化”。

DPSC作为一种可以快速自我更新的成体干细胞，同样具备重编程和再分化的潜能。Yan等〔16〕采用逆转录病毒介导法，将4个因子(Lin28/Nanog/Oct4/Sox2或c-Myc/Klf4/Oct4/Sox2)导入DPSC中，将DPSC重编程为iPS细胞亚群。DPSC来源的iPS细胞亚群表达阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、肿瘤坏死因子受体相关蛋白(TRA)-1-60、TRA-1-80、TRA-2-49、Nanog、Oct4、Sox2等表面标记，具备多向分化的潜能，可分化成3个胚层的组织，而且可被定向诱导分化为神经干细胞和神经元。Tamaoki等〔17〕对多株DPSC进行重编程诱导，结果显示不同株的DPSC在重编程效率方面会有很大差别，不同株DPSC来源的iPS细胞亚群的再分化能力也有较大不同。因此，建立一种高效安全的重编程模式和再分化方法，仍是干细胞领域的研究热点。

5 展望

在口腔医学研究领域，DPSC的分离提取较为方便，常常可以通过分离某些牙源废物的髓质成分获得。因此，该细胞在分离培养方面的便宜性以及本身具有的多向分化潜能、自我更新能力，均在很大程度上决定了该细胞在再生医学中的广泛应用前景。但是，关于DPSC诸多方面的研究尚处于起步阶段，特别是在体内应用性研究方面，仍需进一步探索。所以，只有建立一种高效稳定、安全可靠的DPSC的应用模式，这种成体干细胞才能真正走进临床，服务于人类。

1 Kim BC，Bae H，Kwon IK，et al.Osteoblastic/cementoblastic and neural differentiation of dental stem cells and their applications to tissue engineering and regenerative medicine〔J〕.Tissue Eng Part B Rev，2012.

2 Mori G，Brunetti G，Oranger A，et al.Dental pulp stem cells：osteogenic differentiation and gene expression〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2011;1237：47-52.

3 Gronthos S，Mankani M，Brahim J，et al.Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and in vivo〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(25)：13625-30.

4 Mori G，Brunetti G，Oranger A，et al.Dental pulp stem cells：osteogenic differentiation and gene expression〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2011;1237：47-52.

5 D'Alimonte I，Nargi E，Mastrangelo F，et al.Vascular endothelial growth factor enhances in vitro proliferation and osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells〔J〕.J Biol Regul Homeost Agents，2011;25(1)：57-69.

6 Király M，Kádár K，Horváthy DB，et al.Integration of neuronally predifferentiated human dental pulp stem cells into rat brain in vivo〔J〕.Neurochem Int，2011;59(3)：371-81.

7 Karaöz E，Demircan PC，Saĝlam O，et al.Human dental pulp stem cells demonstrate better neural and epithelial stem cell properties than bone marrow-derived mesenchymal stem cells〔J〕.Histochem Cell Biol，2011;136(4)：455-73.

8 Nozaki T，Ohura K.Gene expression profile of dental pulp cells during differentiation into an adipocyte lineage〔J〕.J Pharmacol Sci，2011;115(3)：354-63.

9 Ito K，Yamada Y，Nakamura S，et al.Osteogenic potential of effective bone engineering using dental pulp stem cells，bone marrow stem cells，and periosteal cells for osseointegration of dental implants〔J〕.Int J Oral Maxillofac Implants，2011;26(5)：947-54.

10 Galler KM，D'Souza RN，Federlin M，et al.Dentin conditioning codetermines cell fate in regenerative endodontics〔J〕.J Endod，2011;37(11)：1536-41.

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14 Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors〔J〕.Cell，2007;131(5)：861-72.

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17 Tamaoki N，Takahashi K，Tanaka T，et al.Dental pulp cells for induced pluripotent stem cell banking〔J〕.J Dent Res，2010;89(8)：773-8.