Th9细胞参与MS和EAE发病机制的研究进展①

徐 文 胡学强 (中山大学附属第三医院神经病学科，广州510630)

学术界普遍认为Th1/Th2和Th17/Treg轴在多发性硬化(Multiple sclerosis，MS)的发病机制中起主要作用。然而，随着免疫学研究的不断发展，我们对于MS免疫学发病机制的认识也不断深入。2008年，Natural immunology上先后刊载了两篇文章，报道了一群能分泌IL-9和IL-10的新型效应性T淋巴细胞亚群，即 Th9细胞［1，2］。Th9是一种新的以分泌IL-9为主的CD4+T淋巴细胞亚群。转化生长因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)和 IL-4 能诱导Th0分化成 Th9，同时也可在 TGF-β作用下由Th2细胞转化而来。IL-9不仅由Th9细胞分泌而来，同时，还有少量的IL-9由Th2和Th17分泌［2］。作为一种新发现的T淋巴细胞亚群，已经发现其参与过敏性鼻炎［3］、过敏性哮喘等疾病的发病。本文重点讨论Th9细胞对MS和实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomy elitis，EAE)的可能机制。

1 Th9细胞及其细胞因子的生物学特点

1.1 Th9细胞 Th9细胞可由IL-4联合TGF-β刺激CD4+初始T细胞而产生，也可由TGF-β作用于Th2细胞，由Th2转分化而来。这一新的细胞亚群不表达已知的Th1、Th2、Treg、Th17各自主要的转录因子 T-bet、GATA-3、Foxp3 以及 RORγt［2］。IL-9 与IL-2、IL-4、IL-7、IL-15 和 IL-21 属同一细胞因子家族，并且共用一条γ链。故认为在IL-4、TGF-β联合刺激CD4+初始T细胞分泌IL-9、IL-10时，同时促进了其他效应性T细胞的分化和生成［1］。Dardalhon等［1］认为 IL-4能阻断 TNF-β诱导 Treg细胞表达其转录因子Foxp3，令人惊讶的是，IL-4与TNF-β能诱导Foxp3-效应性T细胞分化IL-9和IL-10。

有研究认为Th9细胞的特异性转录因子是PU.1［4］，PU.1 是 ETS(E-twenty six，ETS)转录因子家族成员之一，PU.1的异常表达会使Th2细胞因子的产物减少，而促使Th2向Th9转化，PU.1能适当诱导 Th1、Treg、Th17 等产生 IL-9，PU.1 能抑制 Th2相关细胞因子的产生，而促进Th9分化的表型［5］。研究发现，PU.1缺陷的小鼠T细胞分泌低水平的IL-9，而利用逆转录病毒诱导PU.1异位表达则产生大量的IL-9。这些结果说明PU.1对Th9的分化尤为重要。定量PCR和ELISA检测其PU.1的mRNA含量，与Th1、Th2及 Th17相比，Th9细胞 PU.1的mRNA含量高表达，有趣的是，Treg细胞的PU.1转录水平却高于Th9。进一步研究认为，在Treg细胞，PU.1缺陷不会影响Foxp3的表达［4］。据此认为，在人类Th9细胞，PU.1是IL-9不可或缺的转录因子。然而，PU.1并不是促进Th9细胞分化和发育的唯一转录因子。研究证明，转录因子IRF-4对Th9细胞的发育和功能的维持必不可少。IRF-4缺陷的小鼠T细胞不能分化成Th9，同样，利用siRNA技术下调IRF-4会显著抑制Th9细胞分泌IL-9［6］。

1.2 IL-9/IL-9R的构成及结构 人类的IL-9基因位于第5号染色体长臂上的Th2的细胞因子基因簇上(5q31-35)，而小鼠的IL-9基因位于第13号染色体上［7］。人和小鼠的IL-9有着类似的基因构成，长约14 kb，分别有5个外显子和4个内含子。人与小鼠的5个外显子大小相同，在核酸水平上的同源性为69%，而在蛋白水平上为55%，成熟的IL-9由144个氨基酸和一段18个氨基酸的信号肽组成［8］。

IL-9R是红细胞生成素受体超家族中的一员，由一条 α链(IL-9Rα)和一条 γ链(γC)组成。人IL-9R基因主要集中于Xq和Yq染色体长臂上的拟常染色体区域，靠近端粒处。基因长约17 kb，由11个外显子和10个内含子组成［9，10］。鼠IL-9R基因则位于第11号染色体上。IL-9通过和IL-9R结合而介导的信号转导是依赖JAK/STAT途径的。Jakl和 IL-9R 相连，STAT1、STAT3、STAT5 参与其中［11］。

1.3 IL-10/IL-10R的构成及结构 Th9细胞除了分泌IL-9外，还分泌IL-10，人类IL-10基因位于染色体1q21-32，长约4.7 kb，由4个内含子分隔开的5个外显子组成。鼠的IL-10基因位于染色体1E4，长约5.1 kb。编码人和鼠IL-20、IL-19的基因大约位于 IL-10基因上游90 kb，而编码 Mapkapk2和Dyrk3的基因则位于IL-10基因的下游。相邻的IL-10基因大约200 kb的多个基因片段构成了IL-10的基因簇［12］。

IL-10受体由IL-10R1和IL-10R2两个亚单位组成［13］。编码两个亚单位的基因具有显著的相似性，这两个亚单位均属于Ⅱ型细胞因子受体家族(ClassⅡ cytokine receptor family，CRF2)，CRF2 成员多为跨膜糖蛋白。IL-10R1为大约90～110 kb的糖蛋白，编码基因位于11号染色体［14］，人类 IL-10R2编码基因位于21号染色体［15］。IL-10R1是IL-10受体复合物的特异性成分。而IL-10R2则是其他配体受体复合物的共同成分，如IL-22、IL-26、IL-28、IL-29［16，17］。IL-10 与受体复合物的结合分为两步，首先，IL-10和 IL-10R1结合，IL-10/IL-10R1相互作用改变了其细胞因子结构，随后，IL-10/IL-10R1 复合物与 IL-10R2 结合［18，19］。单独的 IL-10R2不能与 IL-10 结合［20，21］。IL-10R1 主要位于免疫细胞表面，表达量通常很低，大约每个细胞含100～800个分子［21］。有趣的是，单核细胞和巨噬细胞却高表达 IL-10R1［22］。与之相反，IL-10R2 却在多数细胞和组织均有表达，IFN-γ和TNF-α对组织细胞的刺激，均会增加 mRNA 高表达 IL-10R2［23，24］。

2 Th9细胞在MS和EAE中的作用

2.1 IL-9与MS和EAE的关系 IL-9不仅来源于T细胞，还来源于嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和肥大细胞。T细胞中不仅Th9细胞可分泌IL-9，同样作为T淋巴细胞亚群的Th2、Th17也可分泌少量IL-9。IL-9既是一种T细胞因子，又可直接作用于B细胞(可能为B1亚群)，在Ig合成的调控中发挥重要的作用;它可通过抑制嗜酸性粒细胞的凋亡和促进IL-5介导的嗜酸性粒细胞前体的成熟来增加组织中的嗜酸性粒细胞［25］。

研究者对过敏性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)患者血清IL-9进行测定，结果发现，暴露在过敏原中的AR患者血清IL-9浓度明显高于未暴露在过敏原中的AR患者［3］。IL-9可诱导星形胶质细胞表达趋化因子CCL20，并促进Th17向中枢神经系统迁徙。经抗IL-9抗体中和治疗的EAE小鼠模型，其星形胶质细胞趋化因子CCL20表达下降，浸润性Th17的数量也下降，EAE程度可减轻［26］。

IL-9结合TGF-β可促进Th17的分化，Th17也能产生IL-9［27］。与野生型小鼠相比，IL-9R缺陷的小鼠通过减少Th17的水平和巨噬细胞释放IL-6能抵抗EAE发病。也有研究得出，IL-9的促炎作用具有抗原特异性，适应性回输Th9细胞可诱导EAE发病［28］。IL-9可直接作用于Treg细胞(Treg细胞表达IL-9Rα)，增加其抑制作用，并间接作用于Th17细胞(Th17细胞不表达IL-9Rα)，促进其扩增和聚集［26］。

2.2 IL-10与MS和EAE的关系 IL-10最初发现是一种由Th2细胞分泌并具有免疫抑制功能的细胞因子［29］。能抑制 Th1、Th2、Th17介导的免疫应答。IL-10具有抗炎和免疫抑制作用，通过抑制粒细胞、Th1细胞、NK细胞、内皮细胞的促炎作用，进而达到抗炎的目的。动物实验证明IL-10对类风湿性关节炎、炎症性肠病具有抑制炎症的作用，且Ⅰ、Ⅱ期临床试验均有效［30-32］。IL-10同时对某些类型的细胞具有免疫刺激作用。如其对小鼠肥大细胞和胸腺细胞具有生长因子刺激作用。并能增强 CD64和CD163的表达，促进巨噬细胞等的分化，增强机体清除感染及细胞吞噬作用［33］。IL-10对人B细胞的存活，增殖以及分化具有重要的作用。对B细胞存活的影响主要取决于细胞所处于的阶段和状态，同时也与抗凋亡蛋白bcl-2作用有关。IL-10对B细胞增殖的加强作用也受到IL-2和IL-4的影响;并且IL-10可以诱导Bl细胞的分化。IL-10对T细胞的作用主要取决于其对抗原提呈细胞的影响而间接抑制T细胞的活化和细胞因子的分泌。

IL-10与其受体的结合会激活JAK家族的两个成员:Jak1和 Tyk2，其中 Jak1与 IL-10R1相连，而Tyk2 与 IL-10R2 相连［12，34］。IL-10 的信号转导是通过Jak-STAT通路发挥免疫调节作用。在IL-10与IL-10R相互作用时，Jak1与Tyk2通过酪氨酸残基交叉磷酸化而被激活，从而引起转录因子STAT1、STAT3、STAT5的活化并形成同二聚体和异二聚体，进而易位到细胞核启动基因转录。被IL-10活化的基因包括细胞因子信号转导抑制蛋白(Suppressor of cytokine signaling，SOCS)1 和 3［35，36］。SOCS3 的活化对于介导IL-10的抗炎反应有重要的作用［36］。虽然Jak-STAT通路在介导lL-10的免疫条件作用时发挥重要的作用，但也存在其他的信号通路参与了IL-10介导的免疫应答。

IL-10作为一种调节细胞因子被认为与EAE和MS有关［37］。在EAE和MS症状缓解期发现IL-10的扩增［38］，在EAE和MS复发之前，可以发现IL-10水平下调［39］。提示内源性IL-10调节疾病的复发与缓解。有数据表明，外源性IL-10治疗能减少继发进展型(Secondary progressive MS，SPMS)的发病几率［40］。此外，IFN-β治疗成功的 MS患者体内发现IL-10水平的升高，这也揭示了IL-10对MS具有保护作用［41］。研究认为，IL-10在治疗慢性CNS炎症中具有潜在的治疗效果［42］。对于直接给EAE模型IL-10治疗结果不尽相同，Cannella等［43］认为直接静脉注射IL-10会导致EAE症状加重，而非减轻。相反，有些实验给予IL-10治疗则能明显减轻CNS炎症，如每日小鼠颅内注射IL-10明显抑制EAE发病，但这种保护作用在停止颅内注射时很快消失，这提示抑制疾病必须要持续IL-10治疗［44］。对炎症性的脊髓进行 IL-10处理后，RT-PCR显示，IL-3、IL-5、TNF等多种促炎因子的条带消失，证实IL-10可能参与了抑制炎症反应的多个环节［45］。尽管IL-10能促进人和小鼠T细胞产生IL-9，但是阻断IL-10受体却不能阻断这些细胞分泌IL-9［28］。

同时研究发现，通过将IL-9+IL-10+T细胞输入RAG-1缺乏的小鼠体内，可诱导肠炎的发生;若将这群细胞和CD4+CD45RBhi的效应T细胞一起转入小鼠体内，不仅不能阻止疾病的发展，反而会诱导产生外周神经炎，这就说明了IL-9+IL-10+T细胞不但不能抑制炎症发生，反而能够促进炎症的发展，至于是IL-9或IL-10，还是两者均参与诱导组织炎症尚不清楚［1］。

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