动物源产气荚膜梭菌耐药性的研究进展＊

董卫超，刘 凌，杜向党

产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）是一种能够产生多种毒素并且具有芽孢形成能力的革兰氏阳性厌氧杆菌。该菌为条件性致病菌，普遍存在于环境及哺乳动物和禽类的胃肠道中，在条件适宜的情况下能够迅速繁殖并产生毒素。根据该菌所产毒素种类不同 （α、β、ε、ι），可分为 A、B、C、D和 E 5型。其中，A型产气荚膜梭菌主要引起人类的气性坏疽、胃肠道疾病（食物中毒、抗生素样腹泻）、婴幼儿猝死综合症，以及动物腹泻和禽类的坏死性肠炎等；B、C、D和E型产气荚膜梭菌主要引起家畜的肠道疾病，同时C型产气荚膜梭菌还能引起人类的坏死性肠炎［1－2］。多年以来，该菌一直是危害畜牧业发展和人类健康的重要病原菌之一。

近年来，随着抗菌药物的广泛应用，产气荚膜梭菌的耐药性日渐加重，尤其是临床强毒株逐渐出现了多重耐药的典型特点。此种状况势必加速了强毒株的进化适应性及快速扩散，引起对食品安全和人类健康的潜在威胁。动物梭菌病目前在我国兽医临床较为常见，而其耐药性的流行病学资料及耐药机制的研究数据还相对缺乏。因此，本文就动物源产气荚膜梭菌的耐药机制及耐药基因扩散机理作以下综述。

1 动物源产气荚膜梭菌的耐药机制

1．1 四环素类 动物源产气荚膜梭菌对四环素类药物的耐药性较为常见，主要的耐药基因包括tet（K）、tet（L）、tet（M）、tetA（P）和tetB（P）等［1］。其中，tet（M）基因编码核糖体结合蛋白，该蛋白可促进结合于细菌30S亚基的四环素移位，缩短游离态四环素的半衰期，从而降低四环素的抑制作用，导致细菌耐药［3］。tetB（P）编码蛋白与 TetM－like蛋白高度同源［4］。而tet（K）、tet（L）和tetA（P）编码蛋白的功能基本相似，均为四环素外排泵蛋白。

Rood等（1985）报道了猪源产气荚膜梭菌对四环素、大环内酯类－林可胺类、氯霉素等药物的耐药状况。结果还进一步证实，四环素耐药基因位于可接合R－质粒上［5］。Gholamiandehkordi等（2009）在禽源产气荚膜梭菌中检测到tet（K）和tet（L）基因［6］。Slavic等（2010）对多种动物（牛、猪、鸡等）源产气荚膜梭菌四环素类、大环内酯类、林可胺类等抗菌药物耐药状况进行了描述［7］。目前，已在鸡、猪、犬、牛等多种动物源产气荚膜梭菌检测到tetA（P）、tetB（P）、tetB（M）基因［1，4］。

1．2 大环内酯类 动物源产气荚膜梭菌对大环内酯类药物耐药的主要机制有作用靶位改变和主动外排。其中，erm基因主要通过23SrRNA甲基化使抗生素不能与其靶位结合而出现耐药。该耐药现象不仅局限于大环内酯类抗生素，同时也涉及林可胺类类和链阳霉素类，即对大环内酯类－林可胺类－链阳菌素类（macrolide－lincosamide－streptogramin B，MLSB）三类药物同时耐药［8］。mef（A）基因通过编码外排泵介导对四环素耐药［9］。

Berryman等（1994、1995）在猪和人源梭菌上检测到ermBP和erm（Q）基 因［8，10］。此 外，Soge 等（2008）在环境产气荚膜梭菌中检测到erm（B）、erm（Q）和mef（A）基因［9］。提示这些耐药基因已在动物、环境和人源产气荚膜梭菌中广泛存在。

1．3 林可胺类 产气荚膜梭菌对林可霉素类药物耐药主要由lnu基因家族编码的林可霉素核苷酸转移酶介导，该酶可导致林可霉素的修饰或灭活。

Martel等（2004）已在比利时肉鸡中发现lnu（A）或lnu（B）基 因［11］。Gholamiandehkordi 等（2009）在禽源产气荚膜梭菌中检测到lnu（A）和lnu（B）基因［6］。Lyras等（2009）在禽产气荚膜梭菌中发现了lnu（P）基因［12］。

1．4 链阳霉素类 链阳霉素的作用机制与大环内酯类和林可胺类抗生素相似。因此，细菌对该三类药物耐药往往呈现一定的关联。Berryman等（1994，1995）在动物和人体内检测到erm（B）和erm（Q）基因的同时也发现，携带erm（B）和erm（Q）基因的产气荚膜梭菌具有 MLSB耐药表型［8，10］。

1．5 其他类

1．5．1 氯霉素 动物源产气荚膜梭菌对氯霉素的主要耐药机制由氯霉素乙酰转移酶介导，该酶可导致氯霉素修饰或灭活。Rood等（1985，1989）报道了猪源产气荚膜梭菌对氯霉素的耐药状况。杂交试验证实，在这些菌中存在catP和catQ基因［5，13］。

1．5．2 杆菌肽锌 杆菌肽锌是在家禽养殖业广泛应用的一个抗菌促生长剂。最近，我们在杆菌肽锌耐药禽A型产气荚膜梭菌上鉴定了bcrABDR基因。这些基因编码的BcrA、BcrB、BcrD和BcrR蛋白分别和肠球菌杆菌肽锌耐药蛋白存在一定的氨基酸同源性。其中，bcrA和bcrB为必需的外排泵功能基因，可导致杆菌肽锌耐药，而bcrR为调控基因［14］。

1．6．2 利奈唑胺 利奈唑胺是首个获得批准的恶唑烷酮类抗菌药物，对包括耐甲氧西林金黄色葡萄球 菌 （meticillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA）、耐青霉素肺炎双球菌（Penicillin－resistant pneumococci，PR－PnC）及耐万古霉素肠球菌（Vancomycin－resistant enterococci，VRE）在内的大多数革兰氏阳性病原菌均具有强大的抗菌活性。但随着该药的广泛应用，耐药菌株也相继出现。细菌对利奈唑胺的耐药机制主要包括23SrRNA的单个核苷酸突变、cfr基因介导的对23SrRNA的甲基化以及50S核糖体亚基L4蛋白的氨基酸突变等。Holzel等（2010）在猪粪产气荚膜梭菌中检测到rplD基因的单一脱氧核苷酸的突变（C→T），该有义突变可引起相应的氨基酸突变（71G→D71），从而导致对利奈唑胺耐药［2］。

2 动物源产气荚膜梭菌耐药基因的扩散机理

2．1 四环素类 Rood等（1985）发现，猪源产气荚膜梭菌四环素耐药基因位于可接合R－质粒上。通过对人和动物源产气荚膜梭菌中接合型R质粒与pCW3接合型质粒的同源性进行比较，发现在产气荚膜梭菌中检测到的接合型R质粒均源自pCW3－like质粒［5，15］。Lyras等（1996）发现猪源产气荚膜梭菌的接合型质粒pCW3携带tetA（P）、tetB（P）基因［4］。Park等（2010）发现tetB（P）基因可在鸡源产气荚膜梭菌中发生转移［16］。

2．2 大环内酯类－林可胺类－链阳霉素类 Brefort等（1977）在猪源产气荚膜梭菌发现，ermBP基因位于可诱动的非接合质粒上［17］。Berryman等（1995）通过试验推测 产气荚膜梭菌 基因可能源于肠球菌或者链球菌；同时推测erm（Q）基因可能位于接合性质粒上［10］。

Lyras等（2009）证实禽产气荚膜梭菌lnu（P）基因位于转坐因子tISCpe8上，而该转座因子位于接合型质粒pJIR2774上，表明lnu（P）基因可以发生接合转移［12］。

2．3 其他类

2．3．1 氯霉素 Abraham 等（1987）首次在产气荚膜梭菌梭菌中检测到携带氯霉素耐药基因位于转座子——Tn4451（pIP401）和Tn4452（pJIR27）上［18］；接着，Rood等（1989）又证实了猪源产气荚膜梭菌catP位于接合性质粒pIP401上［13］。随后，Lyras等（1998）的报道发现，catD基因的扩散与Tn4451和Tn4453密切关联［19］。

2．3．2 杆菌肽锌 最近，我们在鉴定杆菌肽锌耐药禽A型产气荚膜梭菌bcrABDR基因的基础上，进一步通过接合试验，质粒杂交试验和全基因组测序，证实了该基因位于约26kb的接合型转座子上，该转座子暂命名为Tn4455。该转座子可携带杆菌肽锌耐药基因发生一定频率的接合转移（1．2×10－6～2．8×10－1）［14］。

3 结语与展望

目前，在动物源产气荚膜梭菌中鉴定的耐药基因主要有：四环素耐药基因tet（M）、tetA（P）、tetB（P）、tet（K）和tet（L）；大环内酯类耐药基因erm（B）、erm（Q）和mef（A）；林可胺类耐药基因lnu（A）、lnu（B）和lnu（P）；链阳霉素耐药基因erm（B）和erm（Q）；氯霉素耐药基因catP、catQ和catD；杆菌肽锌耐药基因bcrABDR等。其中erm（B）和erm（Q）基因可引起对大环内酯类－林可胺类－链阳霉素类（MLSB）三类药物的共同耐药。

四环素耐药接合型质粒pCW3是动物源产气荚膜梭菌接合转移的一个重要模式质粒［4－5，20］。其tcp（产气荚膜梭菌接合转移功能区，由11个基因组成）区被鉴定为该质粒发挥接合功能的核心功能区，在已鉴定的大多数产气荚膜梭菌接合型质粒中均高度保守。而转座子Tn4451、Tn4452、Tn4453和Tn4455等也在产气荚膜梭菌耐药相关基因转移中发挥着至关重要的作用［14，18－19］。特定情况下，非接合型质粒也可在接合型质粒的诱动下发生水平转移［8］。

随着动物源产气荚膜梭菌耐药机制的研究深入，新的耐药基因将会被不断发掘，例如近年来在人医和兽医临床革兰氏阳性病原菌 金黄色葡萄球菌肠球菌等）中已出现的可导致对五类药物（氯霉素类、林可胺类、恶唑烷酮类、截短侧耳素类和链阳霉素A，PhLOPSA）共同耐药的cfr基因是否在动物源产气荚膜梭菌中存在目前还不清楚。在产气荚膜梭菌多数接合型质粒中高度保守的tcp区是如何发挥接合功能的，还有待于全面的阐明［20］。随着全基因组测序技术和功能基因组学的快速发展，新的转座子以及接合型转座子将会不断发现，其在产气荚膜梭菌耐药基因及毒素基因的水平转移中发挥的作用尚需进一步的深入认识［14］。

近年来，随着抗菌药物的广泛使用，多药耐药产气荚膜梭菌强毒株不断出现，对动物及人类健康造成了极大威胁。有必要对该菌耐药的发生及传播机制进行深入研究，为临床合理用药和新药研发提供理论依据。

［1］Sasaki Y，Yamamoto K，Tamura Y，et al．Tetracycline－resistance genes ofClostridiumperfringens，ClostridiumsepticumandClostridiumsordelliiisolated from cattle affected with malignant edema［J］．Vet Microbiol，2001，83（1）：61－69．DOI：10．1016／S0378－1135（01）00402－3

［2］Holzel CS，Harms KS，Schwaiger K，et al．Resistance to linezolid in a porcineClostridiumperfringensstrain carrying a mutation in the rplD gene encoding the ribosomal protein L4［J］．Antimicrob Agents Chemother，2010，54（3）：1351－1353．DOI：10．1128／AAC．01208－09

［3］Burdett V．Purification and characterization of Tet（M），aprotein that renders ribosomes resistant to tetracycline［J］．J Biol Chem，1991，266（5）：2872－2877．

［4］Lyras D，Rood JI．Genetic organization and distribution of tetracycline resistance determinants inClostridiumperfringens［J］．Antimicrob Agents Chemother，1996，40（11）：2500－2504．

［5］Rood JI，Buddle JR，Wales AJ，et al．The occurrence of antibiotic resistance inClostridiumperfringensfrom pigs［J］．Aust Vet J，1985，62（8）：276－279．

［6］Gholamiandehkordi A，Eeckhaut V，Lanckriet A，et al．Antimicrobial resistance inClostridiumperfringensisolates from broilers in Belgium［J］．Vet Res Commun，2009，33（8）：1031－1037．

［7］Slavic D，Boerlin P，Fabri M，et al．Antimicrobial susceptibility ofClostridiumperfringensisolates of bovine，chicken，porcine，and turkey origin from Ontario［J］．Can J Vet Res，2011，75（2）：89－97．

［8］Berryman DI，Lyristis M，Rood JI．Cloning and sequence analysis of ermQ，the predominant macrolide－lincosamide－streptogramin B resistance gene inClostridiumperfringens［J］．Antimicrob Agents Chemother，1994，38（5）：1041－1046．

［9］Soge OO，Tivoli LD，Meschke JS，et al．A conjugative macrolide resistance gene，mef（A），in environmentalClostridiumperfringenscarrying multiple macrolide and／or tetracycline resistance genes［J］．J Appl Microbiol，2009，106（1）：34－40．DOI：10．1111／j．1365－2672．2008．03960．x

［10］Berryman DI，Rood JI．The closely related ermB－ermAM genes fromClostridiumperfringens，Enterococcusfaecalis（pAM beta 1），andStreptococcusagalactiae（pIP501）are flanked by variants of a directly repeated sequence［J］．Antimicrob Agents Chemother，1995，39（8）：1830－1834．

［11］Martel A，Devriese LA，Cauwerts K，et al．Susceptibility ofClostridiumperfringensstrains from broiler chickens to antibiotics and anticoccidials［J］．Avian Pathol，2004，33（1）：3－7．

［12］Lyras D，Adams V，Ballard SA，et al．tISCpe8，an IS1595－family lincomycin resistance element located on a conjugative plasmid inClostridiumperfringens［J］．J Bacteriol，2009，191（20）：6345－6351．

［13］Rood JI，Jefferson S，Bannam TL，et al．Hybridization analysis of three chloramphenicol resistance determinants from Clostridium perfringens andClostridiumdifficile［J］．Antimicrob A－gents Chemother，1989，33（9）：1569－1574．DOI：10．1128／AAC．33．9．1569

［14］Du XD，Bannam TL，Han XY，et al．A new bonding type transposon Tn4455identified in poultry bacitracin zinc－resistantClostridiumperfringens［C］．2011Annual Conference Proceedings，Chengdu：China Animal Husbandry and Veterinary Association，2011：618．（in Chinese）杜向党，Trudi L Bannam，Xiaoyan Han，et al．一个新型接合型转座子Tn4455在禽杆菌肽锌耐药产气荚膜梭菌的鉴定［C］．中国畜牧兽医学会．2011年成都学术年会论文集，2011：618－618．

［15］Abraham LJ，Wales AJ，Rood JI．Worldwide distribution of the conjugativeClostridiumperfringenstetracycline resistance plasmid，pCW3［J］．Plasmid，1985，14（1）：37－46．

［16］Park M，Rooney AP，Hecht DW，et al．Phenotypic and genotypic characterization of tetracycline and minocycline resistance inClostridiumperfringens［J］．Arch Microbiol，2010，192（10）：803－810．DOI：10．1007／s00203－010－0605－5

［17］Brefort G，Magot M，Ionesco H，et al．Characterization and transferability ofClostridiumperfringensplasmids［J］．Plasmid，1977，1（1）：52－66．

［18］Abraham LJ，Rood JI．Identification of Tn4451and Tn4452，chloramphenicol resistance transposons fromClostridiumperfringens［J］．J Bacteriol，1987，169（4）：1579－1584．

［19］Lyras D，Storie C，Huggins AS，et al．Chloramphenicol resistance inClostridiumdifficileis encoded on Tn4453transposons that are closely related to Tn4451fromClostridiumperfringens［J］．Antimicrob Agents Chemother，1998，42（7）：1563－1567．

［20］Bannam TL，Teng WL，Bulach D，et al．Functional identification of conjugation and replication regions of the tetracycline resistance plasmid pCW3fromClostridiumperfringens［J］．J Bacteriol，2006，188（13）：4942－4951．