幽门螺杆菌临床菌株克拉霉素耐药性及耐药基因突变位点分析＊

司书梅，张 涛，陈峥宏，王 菲，吴晓娟，綦廷娜，杨廷秀

2.贵阳市第一人民医院，贵阳 550004

幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，Hp）是一种 常见的可持续感染人体胃黏膜的病原体。Hp的感染与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌以及MALT淋巴瘤的发生密切相关，克拉霉素是根除Hp治疗方案中常用抗生素之一。近年来发现，Hp对克拉霉素的耐药性逐年增高，因而了解之有利于临床科学地选择抗菌药物。研究发现，Hp23S r RNA V区上的点突变，与克拉霉素耐药性的产生有关。特对贵阳地区Hp临床耐药菌株的23S r RNA基因突变的特征进行检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质控菌株Hp菌株NCTC l l637，SS1，获赠于中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。

1.1.2Hp临床菌株来源 临床标本来自贵阳市第一人民医院消化科内镜室胃镜检查病人（慢性胃炎 、胃溃疡 、十二指肠球部溃疡）。

1.1.3 引物 采用 Primer blast设计引物，primer1－F：5′－TGGCGTAACGAGATGGGAGCTGT －3′和 primer1－R：5′－AGTCTTTGTGCGAGCTTAGGGA－3′，扩增Hp23S r RNA基因功能区V区（2055～2889）片段。

1.1.4 试剂 哥伦比亚培养基（上海博微生物科技有限公司，批号100724），幽门螺杆菌添加剂（英国，OXOID），MH培养基（杭州天和微生物试剂，批号110105），克拉霉素（中国食品药品检定研究院，批号130558－200902），2×Taq PCR Master MIX（北京天根生化科技有限公司），微需氧产气袋（日本，三菱化学株式会社），厌氧罐（日本，三菱化学株式会社），细菌基因组DNA提取试剂盒（北京三博远志生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1Hp的分离培养和鉴定 无菌操作，将活检组织剪碎迅速接种于哥伦比亚血琼脂培养基，微需氧环境，37℃培养3～6 d。将疑似菌株经革兰染色初步鉴定后划线分离培养，挑取单菌落传代培养，经革兰染色、快速尿素酶试验和Hp16S rDNA特异性PCR扩增［1］进行鉴定，将Hp阳性菌株于绵羊血中－80℃保存。

1.2.2Hp克拉霉素敏感性检测 参照美国临床实验标准化委员会制定的琼脂稀释法检测Hp克拉霉素敏感性，克拉霉素的 MIC≥1μg/m L判为耐药，质控菌株选用 NCTC 11637和SS1。

1.2.3Hp23S r RNA基因片段的PCR扩增和测序 挑选Hp克拉霉素耐药菌株10株，敏感菌株4株，质控菌株NCTC 11637和SS1。用细菌基因组DNA提取试剂盒提取HpDNA。选用引物primer1－F和primer1－R，扩增Hp23S r RNA基因功能区V区片段（2055～2899）。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳观察，交北京诺赛基因测序公司进行测序。

1.2.4Hp23S r RNA基因序列分析 将临床分离株测序所得序列在NCBI中进行BLAST分析，采用CLC Free Workbench 4.5 进 行 比 对 分 析，以 文 献［2－4］的 敏 感 菌 株U27270的基因序列为参考，寻找与耐药性相关的突变位点。

2 结 果

2.1Hp分离培养和鉴定结果 132例临床标本微需氧培养3～6d后，经革兰染色镜检阳性，快速尿素酶试验阳性，16S r DNA鉴定阳性并传代培养，得到可用于药敏试验的纯Hp培养物42例。

2.2Hp临床分离株克拉霉素敏感性 42株贵阳地区Hp临床分离株中克拉霉素敏感株29株，耐药株13株，耐药率为30.9%。

2.3 贵阳地区Hp临床分离株23S r RNA V区基因片段序列的碱基多态性 经测序共得到14株Hp临床分离株和质控菌株NCTC 11637和SS1的23S r RNA V区基因片段序列，其中已有7株基因序列 被 GenBank收录 （GenBank Accession：JQ756441～756447）。

贵阳地区10株Hp临床耐药株中，2144位点有6株为G，4株为A；2183位点10株均为C；2196位点有1株为T，9株为C；2224位点有1株为G，9株为A；2245位点有9株为C，1株为T。4株Hp临床敏感株中，2183位点3株为C，1株为T；2224位点2株为A，2株为G；2245位点4株均为C；克拉霉素敏感的Hp质控菌株NCTC11637与SS1中2245位点均为C，其他位点与参考菌株U27270一致，见表1。

表1 贵阳Hp临床菌株克拉霉素耐药相关突变位点的碱基分布Tab.1 Distribution on locus related with clarithromycin resistance mutations of Helicobacter pylori clinical isolates in Guiyang

3 讨 论

据国外报道，Hp对克拉霉素耐药率为1%～20%。而1999年北京地区为10.0%［5］，2006年西安地区达33.3%［6］，2009年重庆地区为29.17%［7］。本文结果显示，贵阳地区克拉霉素耐药率高达30.9%。

克拉霉素属大环内酯类药物，其抗菌机制是药物穿透入菌体细胞内，与细菌核糖体紧密结合，作用于23S r RNA V区的多肽转移酶环，抑制多肽转移酶活性，影响核糖体的移位过程，阻止肽链延长，从而抑制细菌蛋白质的合成，达到杀菌目的。

Versalovic［8］等首次发现Hp23S r RNA 基因V区上的点突变，与克拉霉素的耐药性的产生有关。各国研 究 者［4，9－11］对Hp23S r RNA V 区 的 研究发现，与克拉霉素耐药相关的突变包括：A2115G、G2141A、 A2143G/C、 A2144G/C/T、 T2183C、A2224G、T2289C、T2717C、C2196T 等。不同国家和地区的克拉霉素耐药菌株23S r RNA基因V区的部分位点存在碱基的多样性。巴西［4］52株克拉霉素耐药株中94.2%有A2143G和A2144G突变，其中A2143G的突变与克拉霉素高水平耐药相关。法国［12］199株Hp耐药率为135/199，127株发生A2144G、A2143G突变，8株发生A2143C突变。孟加拉国［2］12株克拉霉素耐药株中未发生A2143G和A2144G突变，却存在T2183C突变，且该位点的突变与耐药相关。本文对GenBank中序列（Gen－Bank Accession：AB088050－AB088065）分析发现，日本克拉霉素耐药株基因突变主要包括A2143G、A2144G、T2183C 、T2245C，但 T2183C、C2196T、A2224G和T2245C的突变同时也存在于该地区克拉霉素敏感菌株中。

经序列分析，贵阳地区10株耐药菌株的23S r RNA基因片段的碱基突变包括T2183C（10/10）、T2245C（9/10）、A2144G（6/10）、C2196T（1/10）、A2224G（1/10），不存在文献报道的与耐药性有关的A2143G/C突变，而敏感菌株在2183、2245和2224位点也存在碱基的差异。本文有1株耐药菌株发生了C2196T突变，但对GenBank中相关序列的分析发现，该突变也存在于日本敏感菌株（GenBank Accession：AB088050－AB088056）。日本菌株和贵阳菌株一致的是A2144G突变只存在于耐药菌株。综上所述，2144位点突变与贵阳幽门螺杆菌克拉霉素耐药相关，而其他位点的突变是否与耐药性相关有待进一步的研究证实。

［1］Wu XJ，Chen ZH，Wang F.Application of PCR amplification ofHp16S r DNA fragment in the diagnose ofHpinfection［J］.J Mod Lab Med，2010，25（5）：76－78.DOI：10.3969/j.issn.1671－7414.2010.05.028 （in Chinese）

吴晓娟，陈峥宏，王菲.PCR扩增16S r DNA在幽门螺杆菌感染诊断中的运用［J］.现代检验医学杂志，2010，25（5）：76－78.

［2］Khan R，Nahar S，Sultana J，et al.T2182C mutation in 23S rRNA is associated with clarithromycin resistance inHelicobacter pyloriisolates obtained in Bangladesh［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48（9）：3567－3569.DOI：10.1128/AAC.48.9.3567－3569.2004

［3］Barile KA，Silva AL，Xavier JN，et al.Characterization of 23S rRNA domain V mutations in gastric biopsy patients from the eastern Amazon［J］.Mem Inst Oswaldo Cruz，2010，105（3）：314－317.

［4］Ribeiro ML，Vitiello L，Miranda MC，et al.Mutations in the 23S r RNA gene are associated with clarithromycin resistance inHelicobacterpyloriisolates in Brazil［J］.Ann Clin Microbiol Antimicrob，2003，21：2－11.DOI：10.1186/1476－0711－2－11

［5］Chen H，Hu FL.The epidemiology ofHelicobacterpyloriresistance to antibiotics in Beijing［J］.Chin Med J，2005，85（39）：23－26.DOI：10.3760/j：issn：0376－2491.2005.39.007（in Chinese）

成虹，胡伏莲.北京地区幽门螺杆菌耐药情况及其变化趋势［J］.中华医学杂志，2005，85（39）：23－26.

［6］Yao CL，Zhu JW，Li JP.Analysis of the drug resistance withHelicobacterpyloriin Xi－an area in 2005［J］.J Practical Med Tech，2006，20（13）：3590－3591.（in Chinese）

姚创利，朱建伟，李建平.2005年西安地区幽门螺杆菌耐药性分析［J］.实用医技杂志，2006，20（13）：3590－3591.

［7］Luo HC，Lv L，Yang ZC，et al.Prevalence and molecular mechanism ofHelicobacterpyloriresistant to clarithromycin in Chongqing area［J］.J Chongqing Med Univ，2009，34（8）：1077－1080.（in Chinese）

罗红春，吕琳，杨致邦，等.重庆地区分离幽门螺杆菌对克拉霉素耐药 性 研 究 ［J］. 重 庆 医 科 大 学 学 报，2009，34（8）：1077－1080.

［8］Versalovic J，Shortridge D，Kibler K，et al.Mutations in 23S rRNA are associated with clarithromycin resistance inHelicobacterpylori［J］.Antimicrob Agents Chemother，1996，40（2）：477－480.

［9］Van Doorn LJ，Debets－Ossnkopp YJ，Marais A，et al.Rapid associated with macrolide resistance detection，by PCR and reverse hybridization，of mutations in theHelicobacterpylori23S r RNA gene，associated with macrolide resistance［J］.Antimicrob A－gents Chemother，1999，43（7）：1779－1782.

［10］Moder KA，Layer F，Konig W，et al.Rapid screening of clarithromycin resistance inHelicobacterpyloriby pyrosequencing［J］.J Med Microbiol，2007，56（10）：1370－1376.DOI：10.1099/jmm.0.47371－0

［11］Kim JM，Kim JS，Kim N，et al.Gene mutations of 23S r RNA associated with clarithromycin resistance inHelicobacterpyloristrains isolated from Korean Patients［J］.J Microbiol Biotechnol，2008，18（9）：1584－1589.

［12］Oleastro M，Menard A，Santos A，et al.Real－time PCR assay for rapid and accurate detection of point mutations conferring resistance to clarithromycin inHelicobacterpylori［J］.J Clin Microbiol，2003，41 （1）：397－402.DOI：10.1128/jcm.41.1.397－402.2003