诱导性多能干细胞在遗传性心脏病实验研究中的应用①

周云国，曹玲玲，洪葵

遗传性心脏病是一类由遗传因素引起的心脏病，是引起致命性心律失常和猝死的主要原因。遗传性心脏病包括心脏结构异常的心肌病和心脏结构正常的离子通道病，如长Q-T综合征、短Q-T综合征等。目前，遗传性心脏病有效治疗手段欠缺。尽管近年来微创手术和内科介入有了发展，新型药物研发应用也为患者带来一定帮助，患病率和病死率仍然居高不下。

以往遗传性心脏病的研究多数利用动物模型或现有其他组织细胞株，而伦理等问题使人类胚胎干细胞的研究工作受到限制。诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS细胞)因无伦理学限制且具有疾病特异性，已成为心血管病领域的研究热点，为遗传性心脏病发病机制的研究及治疗带来了曙光。

1 iPS细胞概况

2006年，Takahashi和Yamanaka等首次通过病毒载体系统向小鼠成纤维细胞导入4种基因：Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4，成功地将已分化成熟的小鼠正常体细胞去分化重编程为胚胎干细胞(ES)样细胞，并命名为iPS细胞[1]。iPS细胞形态、端粒酶活性、核型以及细胞表面标志均与ES相似，在体外悬浮培养可形成拟胚体，接种至严重联合免疫缺陷病(serious combined immunodeficiency disease,SCID)小鼠体内可形成具有3个胚层的畸胎瘤，即具有全能性。2007年，美、日两国科学家又使用人体细胞获得了iPS细胞[2-3]。2009年，我国科学家周琪教授与曾凡一教授团队合作，利用iPS细胞通过四倍体囊胚注射法，得到存活并具有繁殖能力的小鼠，在世界上首次获得完全由iPS细胞制备的活体小鼠，有力地证明了iPS细胞具有真正的全能性，同时也为iPS细胞的安全性提供了可靠的依据[4]。

最初的iPS细胞具有罹患肿瘤的风险，可能原因包括c-Myc基因是癌基因，携带该基因的病毒转录到体细胞中可使c-Myc基因激活和表达[5]。为了避免肿瘤患病风险，科学家们已经利用非整合性病毒、小分子化合物或蛋白质等方法成功建立了iPS细胞系，但这些方法还存在诱导效率低的问题[6-7]。最近，中川昭一等用L-Myc代替c-Myc将iPS细胞分化发育成嵌合体小鼠。L-Myc提高了人类体细胞的重编程效率，并促进嵌合体小鼠的种系形成能力，但不增加肿瘤发生率[8]。Stadtfeld等应用不会被整合到宿主基因组内的腺病毒及质粒作为载体，可降低iPS细胞转导后肿瘤发生率[9]。这些改进为今后的临床研究提供了更多安全保证。

目前iPS细胞不仅可以来源于成纤维细胞，还可以来源于体内其他已经分化的细胞，如肝细胞、β细胞，从而提高了iPS细胞来源的可行性。iPS细胞在适当的培养条件下能进一步分化为神经干细胞、功能性心肌细胞、肝细胞、骨细胞等体内大部分细胞，具有与ES相似的多向分化潜能，有可能取代干细胞进入临床研究。

2 iPS细胞分化为心肌细胞

随着基因技术不断改进，大部分疾病可以通过建立特定基因的小鼠模型进行研究。但高血压、高脂血症、冠心病等疾病，目前并不明确哪些基因起主导作用，离子通道病等疾病模型的建立也受到极大限制，而且动物疾病模型并不能完全真实地再现人体疾病的发生过程。iPS细胞保留了患者的特殊基因型，为研究遗传性疾病发病机制、治疗方法提供了机遇。

2008年，Park等首次将包括1型糖尿病、帕金森病、亨廷顿病和唐氏综合征在内10种遗传疾病的患者体细胞诱导成iPS细胞，鉴定后肯定了这10种iPS细胞的全能性[10]。同年，Mauritz和Narazaki的两个研究小组将小鼠iPS细胞成功分化为心肌细胞[11-12]。2009年，Zhang等进一步将人类iPS细胞分化为功能性心肌细胞[13]。但心肌细胞分化效率低，且分化出的细胞不纯。Laflamme等通过添加一些信号分子，如激活素A(Activin A)和骨形态生成蛋白4(BMP-4)，提高了心肌细胞分化效率[14]。

利用iPS技术获得人类心肌细胞可以为患者量身定做疾病特异性细胞系。Nelson等把iPS技术运用于探索心脏病的治疗：他们将普通小鼠成纤维细胞重编程为iPS细胞并植入小鼠子宫内，分化出心脏实质细胞，再将心脏实质细胞植入受损的小鼠心脏，2周后嫁接，4周后明显改善受损心脏的结构和功能，使心肌细胞收缩性恢复且电位稳定性增强[15]。之后，大量科学家对iPS技术应用于心脏病治疗展开了进一步的研究和探索[16-18]。这一技术可以为个性化治疗、药物疗效评估甚至疾病发病机制的研究提供方便，在临床药物试验中可能不再需要大量患者作为试验对象。

3 iPS在遗传性心脏病领域中的应用

iPS细胞来源的心肌细胞携带疾病特异基因的优点使其成为遗传性心脏病研究中的重要工具。2010年，Moretti等首次将遗传性心脏病患者的皮肤成纤维细胞重编程为心肌细胞，建立了1型长Q-T综合征的细胞模型[19]。同年，Lemischka等构建了LEOPARD综合征(以肥厚性心肌病为主要症状)的细胞模型[20]。2011年，Itzhaki等将1例2型长Q-T综合征患者的皮肤成纤维细胞诱导重编程为iPS细胞，通过模拟心肌细胞分化的过程，进一步诱导iPS细胞分化成心肌细胞。RT-PCR及免疫荧光染色技术证实该心肌细胞具有α-肌球蛋白重链、心肌特异肌钙蛋白I、肌球蛋白轻链2α和连接蛋白CX43等心肌特异表达标志，膜片钳和胞外多电极记录显示该细胞的Q-T间期明显延长，电压钳证实动作电位延长主要起源于心肌细胞钾离子流明显减少。更重要的是，此细胞主要表现出早后除极和触发性心律失常[21]。Yazawa等将源于Timothy综合征患者的皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞，进一步诱导分化成心肌细胞，应用电生理记录和钙离子成像技术显示了细胞的异常收缩、过度钙离子内流、动作电位延长、异常的生物电活性和钙瞬变[22]。iPS技术可应用于制作疾病特异性遗传性心脏病细胞模型，在新药开发、药效学、毒理学等研究方面具有良好的应用前景。

4 总结与展望

以患者自身体细胞诱导的多能干细胞，细胞取材广，不存在伦理学争议；重编程的iPS细胞具有全能性、安全性以及疾病特异性。iPS技术的以上优点，为研究遗传性心脏病发病机制和治疗带来希望。然而，目前iPS技术研究还处于起步阶段，还有一系列问题有待深入系统研究，如成熟体细胞重编程为iPS细胞的效率低；iPS细胞重编程和再分化的分子机制尚不清楚；虽然通过改变转录因子和载体系统后，植入iPS细胞罹患肿瘤的风险有所降低，但是致癌性仍不可避免[23]。

一种新技术在发展之初都会存在许多理论和技术上的问题，iPS技术目前并非尽善尽美，但应用iPS技术建立疾病特异性细胞模型，仍为研究疾病机制、筛选有效药物、个体化治疗等带来新的希望。

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