广西甜茶质量控制方法的研究进展

吴柳春

广西柳州食品药品检验所，广西 柳州 545006

广西甜茶质量控制方法的研究进展

吴柳春

广西柳州食品药品检验所，广西 柳州 545006

本文介绍了1980年～2012年来广西甜茶质量控制方法的研究进展，按照定性、检查、定量测定指标性成分的质量控制模式将文献分类进行综述。

广西甜茶;化学成分;含量测定;综述

广西甜茶是广西特有的药食同源的野生珍稀甜味植物，与罗汉果、甜叶菊并称广西三大甜味植物。为蔷薇科植物甜叶悬钩子 Rubus Suavissimus S.Lee.的干燥叶［1］，主要分布于柳州、桂林、梧州等地区。性味甘、平、无毒，具有无糖自然甜的神奇效果，在广西民间以叶当茶饮用历史悠久，民间又称之为“神茶”;入药有清热、润肺、祛痰、止咳的功效，用于咳嗽痰多，或作甜味剂［2］。

广西甜茶的主要化学成分有:甜茶甙 (Rubusoside)又称甜茶素，是广西甜茶的主要甜味成分及活性成分。为斯特维 (Steviol)和葡萄糖结合而成的四环二萜甙［3－5］，甜茶苷的甜度约为蔗糖甜度的300倍［6］，是低热值、甜度高、食用极为安全的天然甜味剂;黄酮类化合物是甜茶中的重要化学成分，其甙元为槲皮素和山奈酚［7］，具有抗氧化、预防心血管疾病等作用;多酚类物质一直都是甜茶中的重要活性成分，富含特有的GOD型鞣花单宁，是治疗对花粉症等鼻炎过敏反应的活性物质［8］。甜茶叶中含有7个多酚型化合物［9］，其抗过敏有效成分为水解型鞣花鞣质［10］;甜茶叶营养成分丰富，含有蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素、粗纤维等［6］。现将广西甜茶质量控制方面三十多年来的研究进展作如下综述。

1 定性鉴别

1.1 植物形态与性状鉴定 早在1981年，广西植物研究所的李树刚教授［1］就对甜茶原植物进行详细描述和鉴定。广西甜茶为蔷薇科悬钩子属的一个新种 (Rubus Summissimus S.Lee.)，多年生有刺落叶灌木，高1～3米，茎直立或倾斜，常被白粉，幼苗时紫红色;单叶互生，幼苗时初生叶5深裂 (绝不为3深裂)，叶纸质，近圆形，先端渐尖，边缘具重锯齿，叶甚甜;花单生叶腋，白色，直径2～3cm，垂生，单花瓣5片;聚合果卵球形，幼时灰青色，熟时橙红色，味甜可食。

甜茶叶干品［2］多皱缩，黄绿色或浅黄棕色。完整叶展平后轮廓近圆形，长5.2～11cm，宽5～13cm，基部近心形或狭心形，掌状5～7深裂，裂片披针形或椭圆形，中央裂片较长，先端渐尖，边缘具重锯齿，基出脉通常7或5条，两面稍突起。叶柄长2～5cm，上面有浅槽，下面具小刺1～2枚。气微，味甜。

韦家福和黄燮才1996年也发表文章［11］对广西各地俗称甜茶的原植物进行鉴定甄别。陆健、李远志［12］等对甜茶的植物学形态特性提出真假甜茶的鉴别方法。

银胜高、刘君玲［13］等人对甜茶的植物形态与性状进行定性鉴别研究。

1.2 显微鉴别 银胜高、杜兰哲［14］等人采用石蜡切片技术对广西甜茶的根、茎、叶进行处理后，运用显微摄影技术进行显微鉴别研究，其实验结果如下。

1.2.1 根横切面 呈类圆形，由木栓层、次生维管束组成。木栓层稍厚，由十多列扁平类长方形细胞组成;皮层较窄，细胞排列疏松，偶见草酸钙簇晶;维管束外韧型，韧皮部较宽，有纤维束散在，在髓射线上的薄壁细胞可见大量草酸钙簇晶;形成层明显;木质部约占整个切面直径的2/3，细胞木化，导管类圆形常以单个或2～3个相聚的形式均匀呈放射状排列;射线明显，排列较整齐。

1.2.2 茎横切面 呈类圆形，茎由表皮、皮层、维管束和髓等组成。表皮细胞1列，类方形或类圆形，排列整齐，外被角质层;皮层细胞排列紧密，薄壁细胞含有草酸钙簇晶单个散在;内皮层明显，类方形或类长方形，排列整齐;维管束外韧型，断续成环;韧皮部较窄，有帽状的纤维束，形成层明显，维管束断续成环;髓部宽广，约占4/5，细胞较大，排列疏松。

1.2.3 叶横切面叶 由表皮、叶肉和维管束组成。上表皮细胞1列，长方形或方形;下表皮细胞1列，类方形或类圆形，较小，可见气孔;上下表皮外被角质层，呈细齿状;叶肉由栅栏组织和海绵组织组成;栅栏组织2列细胞，不通过主脉;海绵组织疏松，细胞内偶见簇晶;主脉维管束1个;木质部位于向茎面，导管类圆形常以单个或2～3个相聚的形式纵向排列;形成层明显;韧皮部位于背茎面，有大量草酸钙簇晶;主脉出上下表皮内侧均具厚角组织;薄壁细胞中可见大量簇晶。

粉末［13］黄绿色或浅黄棕色。非腺毛由单细胞组成，表面光滑细长，直径14～20μm;螺纹导管多见，直径10～25μm;纤维较少，直径11～17μm;草酸钙簇晶多见，直径5～18μm。

1.3 理化鉴别

1.3.1 酒石酸铁法试验［12］取甜茶3克，加入150ml沸水冲泡5min，滤过。取滤液 0.5ml，加 10ml水显色剂 (取0.1gFeSO4·7H2O和0.5g酒石酸钾钠配成100ml水溶液为显色剂)，混合后溶液呈蓝褐色 (检测多酚类成分)。

1.3.2 三氯化铝法试验［12］取甜茶3g，加入150ml沸水冲泡5min后滤过。取滤液0.5ml，加10ml显色剂 (取1.8 g A LCI 3.6 H2O，定容100ml水溶液为显色剂)，混合后溶液呈浅橙黄色 (检测黄酮类成分)。

1.3.3 碱液试验［13］取甜茶水提溶液点于滤纸片上，(干后，再点一次，使其溶液集中)，干后，在氨蒸气中熏约5 min，呈现橙黄色。将氨气熏过的滤纸露置空气中，颜色逐渐褪去而变为原有的暗黑色。(检测黄酮类或苷类成分)

1.3.4 α－萘酚试验［13］取甜茶水提溶液1 ml置试管中，加5%α－萘酚试液数滴振摇后，沿管壁滴入5～6滴浓硫酸，液体分层，待2～3 min后，两层液面间出现紫红色环。(检测甜茶苷类成分)。

1.3.5 泡沫试验［13］取甜茶水提溶液2ml置带塞试管中，用力振摇约3min，产生持久性蜂窝状泡沫 (可持续10min以上)，且泡沫量约为液体体积的1/3(检测皂苷类成分)。

1.4 薄层色谱鉴别

1.4.1 取甜茶［12］10g用50ml乙醇浸提，提取液点于硅胶薄板或滤纸上，晾干，喷洒5%磷酸铝乙醇溶液，喷后置于120℃ 烘箱中烘烤15min，呈蓝色斑点 (检测甜茶苷类成分)。

1.4.2 取甜茶［13］1g，加水30ml超声60min，过滤，滤液作为供试品溶液。另取甜茶素适量，用水溶液配成每1ml含1.0mg的溶液，作为对照品溶液。参照薄层色谱法 (中国药典2005年一部附录UIB)试验，分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10～15μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿－甲醇－水 (5∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干放入碘缸中显色，5min后检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同黄色斑点，Rf值为0.73(检测甜茶苷类成分)。

1.5 红外光谱鉴别 傅里叶变换红外光谱方法具有准确、简便、快速和经济的特点，已广泛应用于中药及中药材真伪鉴别。唐辉、孔德鑫［15］等人运用傅里叶变换红外光谱法，采集7份不同产地甜茶叶片的FTIR图谱，结合相关性系数和二阶导数方法对其红外光谱特征进行指认，并比较各供试甜茶的红外指纹图谱及甜茶苷含量间差异。研究结果表明，运用FTIR技术可以对不同产地甜茶进行快速鉴别。

1.6 高效液相色谱鉴别 张巧云［16］利用RP－HPLC法，根据HPLC的保留时间定性和加入法定性原理，鉴别甜茶叶中甜茶素、黄酮甙元 (槲皮素与山奈酚)。甜茶素色谱条件为:色谱柱:Turner YWG C18(5μm，4.6mm×250mm);流动相:V(甲醇) ∶V(水) =70∶30;流速:1.0mL/min;检测波长:210nm;灵敏度:0.005;柱温:室温。黄酮甙元 (槲皮素与山奈酚)色谱条件为:色谱柱:Turner YWG C18(5μm，4.6mm ×250mm);流动相:V(甲醇):V(水):V(磷酸) =60:40:0.3流速:1.0mL/min;检测波长:360nm;灵敏度:0.005;柱温:室温。

2 检查

陆健、李远志［12］等率先报道用茂福炉法测定灰分、用全量法测定水浸出物来控制广西甜茶质量。

银胜高、刘君玲［13］等人参照中国药典2005年版一部附录，分别对广西瑶山甜茶样品中的水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物 (冷浸和热浸)进行测定，较全面的开展了甜茶常规检查项目研究。

3 含量测定

3.1 甜茶苷 吴祖祥、孟丽珊［17］等人采用薄层层离－分光光度法测定甜茶中甜茶素的含量。其方法首先把苷加酸水解为异苷元 (isosteviol)，再将异苷元和2，4一二硝基苯肼作用制成腙，经薄层分离后将色带洗脱，在362nm处测定吸收值。该方法流程较长，操作繁琐，全程加样回收率为96.85±1.89%。

卢昕等［18］首次采用反相高效液相色谱法测定了广西甜茶中的甜茶素。条件为:反相C18柱;甲醇－水 (体积比85:15)溶液为流动相，流速1.0 mL/min;检测波长210 nm;柱温20℃;外标法定量。结果表明:甜茶素的质量浓度为20～1200mg/L时，其峰面积与质量浓度具有良好的线性关系，相关系数为0.998。方法的检测限 (S/N≥3)为5 mg/L，峰面积测定值的相标准偏差 (RSD)为0.85%(n=8)。甜茶素工业品及甜茶原叶中甜茶素的平均回收率 (n=3)分别为100.2%和104.9%。该方法快速简便，准确可靠，可用于甜茶产品质量的例行监测。

张健、叶丽琼［19］采用高效液相色谱法测定广西甜茶中的主要甜味成分甜茶苷，色谱条件:C18柱;甲醇－三氟乙酸溶液 (体积比为75∶25)为流动相;流速1.0mL/min;检测波长208 nm;柱温30℃;外标法定量。结果表明:线性范围为300mg/L～2000mg/L，相关系数r为0.999 1，平均回收率 (n=3)为103.9%。该方法对不同生长时期甜茶叶中的甜茶苷含量进行测定，考查了其中的变化规律。

银胜高、刘君玲［13］等人以甜茶素为指标，采用高效液相色谱法测定广西甜茶含量。色谱条件:色谱柱为Water Symmetry C18柱 (150mm×4.6mm，5μm);流动相为乙腈－水 (32∶68);进样量10μL;流速1mL/min;检测波长205nm;柱温35℃;外标法定量。结果表明:线性范围为1.038～10.38μg，相关系数r为0.9999。平均回收率 (n=6)为98.31%，RSD为1.62%。该实验方法可行，重复性好，能有效控制广西甜茶药材的质量。

超高效液相色谱－质谱法 (UPLC－MS)是21世纪初发展起来的一种分析技术，它是结合了UPLC的高效分离能力与MS的高灵敏度和极强的专属性的分离检测技术。张健、俞桂新［20］等人首次采用超高效液相色谱－质谱联用法测定广西甜茶叶中甜茶苷的含量。样品经前处理后以Acquity UPLCBEH C18柱为色谱柱，流动相为乙腈 (含体积分数为0.1%甲酸) －蒸馏水 (含体积分数0.1%甲酸)，梯度条件为10 min乙腈相体积由20%变化到65%，柱温35℃，进样量5 μL，流速0.15mL/min。在质谱仪上以电喷雾电离正离子模式多离子反应监测 (MRM)方式进行定量分析，监测的离子为 m/Z 643→319。甜茶苷的线性范围0.1—10.0 μg/mL，r=0.9996，加标回收率为96.6%，检出限0.04μg/mL;定量下限为0.1μg/mL。该法操作简便、灵敏度高、重复性好，可快速测定甜茶叶中甜茶苷含量。

樊兰兰、韦玮［21］等人采用超快速液相色谱法 (RSLC－DAD)，建立了广西甜茶制剂中甜茶素含量的测定方法。色谱条件:色谱柱为Dionex RSLC 120 C18柱 (50mm×2.1mm，2.2μm)，流动相为乙腈－水 (36∶64)，检测波长205nm，柱温40℃，流速0.3mL/min，进样量2μLl。结果:甜茶素的线性范围为0.03～0.6μg;加样回收率为99.1%，RSD为0.97%(n=9);21份在中国和日本市售甜茶制剂中甜茶素的含量范围为0～63.79mg/g。该检测方法简便、快速、可靠，可显著缩短分析时间和节省有机溶剂，为建立科学合理的广西甜茶制剂质量标准提供依据。

3.2 黄酮类 陆健、李远志［12］等用硼酸一柠檬酸比色法测定广西甜茶中的黄酮含量。

陈全斌、谭冬明［22］等利用高效液相色谱法，测定广西甜茶不同部位总黄酮含量，色谱条件:Hypersil C18(5μm，4.6mm×250mm)为色谱柱;V甲醇∶V水∶V磷酸 (60∶40∶0.3)为流动相;流速:1.0mL/min;检测波长:360nm;灵敏度:005;柱温:室温。试验结果表明:甜茶各部位总黄酮含量由高到低的排列顺序是:嫩叶、中茎皮、老茎皮、果实、嫩茎皮、老叶、中茎、老茎;根部和嫩茎的黄酮含量为零。嫩叶的含量最高，但老叶的含量却较低。为了解和掌握广西甜茶植株黄酮类化学成分分布提供理论依据。

吴柳春和黄桂华［23］建立广西甜茶中黄酮苷元槲皮素和山奈酚的HPLC定量分析方法。色谱条件:以Shim－pack VP－ODS(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱，甲醇－0.4﹪磷酸 (52∶48)为流动相，流速 1.0 mL·min－1，检测波长370nm，柱温40℃。结果:槲皮素和山奈酚的线性范围分别为0.2310～1.2780μg及0.1918～1.1511μg;平均回收率分别为100.3﹪ (RSD=1.6﹪)和97.8﹪ (RSD=1.2﹪)。所建立的方法准确、可靠，重现性好，可用于广西甜茶中黄酮成分的定量分析，能有效控制广西甜茶的内在质量。

3.3 多酚类 陆健、李远志［12］等利用鞣质有较多酚羟基易被氧化的性质，用高锰酸钾滴定法测定广西甜茶中的多酚类含量。

莫建光、陈秋虹［24］等建立高效液相色谱法测定广西甜茶中水解型鞣花鞣质含量的方法。色谱条件:WatersC18柱(250.0mm×4.6mm，5μm)，柱温40℃，用乙腈－0.2%磷酸(体积比18∶82)为流动相，检测波长为254nm，外标法定量。结果:鞣花酸在0.1000～0.8755mg/ml内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.9991，最低检出限为0.65μg/ml，平均加标回收率为97.12%，RSD为1.04%。该方法精确可靠，可作为广西甜茶中水解型鞣花鞣质含量测定的方法。

3.4 氨基酸和微量元素 陆健、李远志［12］等用茚三酮显色分光光度法测定游离氨基酸;用日立825型氨基酸自动分析仪测定水解氨基酸。

温桂清、陈全斌［25］等采用火焰原子吸收光谱法(FAAS)测定广西甜茶根、茎和叶中的微量元素 (Ca、K、Na、Mg、Cu、Fe、Zn和 Mn)的含量。仪器工作条件:WFX－1F2型原子吸收分光光度计;Ca、K、Na、Mg、Cu、Fe、Zn和Mn共8种元素空心阴极灯。结果:标准曲线的相关系数为0.995 5～0.999 6，相对标准偏差为0.53% ～2.02%，加标回收率为97.7%～103.3%;甜茶根、茎和叶的金属元素含量次序为:K ＞Mg＞Ca＞Fe＞Na＞Zn(Mn) ＞Cu，甜茶叶的Ca、K、Na、Mg和Mn含量明显大于根和茎。火焰原子吸收光度法测定广西甜茶中微量元素，具有很好的精密度和准确度。

温桂清、陈全斌［26］等再次采用FAAS法测定甜茶不同部位的重金属铅和镉。即将甜茶样品的根、茎和叶经烘干、灰化及灼烧，用浓硝酸溶解残渣，利用火焰原子吸收光谱 (FAAS)法对溶解液中的重金属元素铅和镉进行了测定。Pb和Cd标准曲线的相关系数分别为0.999 0和0.993 8，相对标准偏差为0.26%～1.38%，加标回收率为99.3%～101.2%。结果表明所测甜茶的根、茎和叶中Pb的含量均超过国家标准。

3.5 其它成分 陆健、李远志［12］等采用蒽酮显色分光光度法测定广西甜茶中的总水溶性碳水化合物含量及采用分光光度法测定叶绿素含量。

邹青松、陈山［27］等为探明瑶山甜茶中可溶性糖的含量和种类，采用蒽酮－硫酸比色法测定其可溶性总糖含量;运用高效凝胶过滤色谱法 (HPGFC)测定多糖分子量分布范围，并利用高效液相色谱－蒸发光散射检测器 (HPGFC－ELSD)法在两种流动相体系中测定和分析其低分子寡糖和单糖的种类与含量。结果表明:瑶山甜茶中可溶性总糖含量为15.20%，相对标准偏差 (RSD)为0.996%;多糖分子量Mw范围为51551～55628，RSD为0.64% ～1.23%;单糖种类主要为木糖、果糖和葡萄糖，相对含量分别是0.54%、52.18%和42.76%。实验表明，本文所建立的实验方法重现性较好，操作性强，可用于瑶山甜茶的糖类分析，为瑶山甜茶这一优良的食药两用资源的产品深开发提供实验数据和依据。

4 结语

广西甜茶具有“茶、糖、药”三种功效，是一种极具开发价值的糖类替代品和保健品。目前广西甜茶现行的质量标准较为简单［2］，仅有性状鉴别项目。从上述文献可知，目前国内专家学者对广西甜茶质量控制方法的研究文献报道较全面，研究方法与检测技术与时俱进。特别是近年来，在定性定量项目方面运用了许多新技术、新方法，包括显微摄影技术、红外指纹图谱鉴别、高效液相色谱法、超高效液相色谱－质谱联用法、原子吸收光谱法等，它们具有高灵敏度、高准确度、专属性强的共同特点，将会成为甜茶质量控制分析方法的重要手段。如何制定科学合理的广西甜茶质量标准，全面监控甜茶的内在质量，保证甜茶的有效性和安全性，提高市场竞争力，是摆在我们面前的一项急迫的任务。

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R284.1

A

1007－8517(2012)15－0053－03

吴柳春 (1963－)，女，汉族，湖北黄陂人，大专，主管药师，主要从事中药质量分析和质量管理工作。E－mail:liuchunwu63@yahoo.com.cn。

2012.05.29)