MLVA方法在军团菌分子分型中的应用评价＊

朱兵清，任红宇，周海健，关 红，邵祝军

MLVA方法在军团菌分子分型中的应用评价＊

朱兵清，任红宇，周海健，关 红，邵祝军

目的探讨MLVA方法在军团菌分型中的可应用性。方法选用文献报道的9个军团菌VNTR位点，对我国环境水中分离的81株Lp1型军团菌菌株和2株参考菌株进行分子分型研究，并与PFGE和SBT分型结果进行了比较。结果81株分离菌株9个VNTR位点的等位基因型别数分别为6，3，4，2，3，3，2，4和7，其中部分菌株的某些位点无扩增产物或产物为非目的片断。7个位点PCR产物具有重复单元；Lpms3位点PCR产物无重复单元；Lpms31位点部分菌株PCR产物有重复单元，另一些菌株无重复单元。对于具有重复单元的序列，不同菌株间以及同一菌株内各重复单元的序列变异均较大，3个位点存在不完整的重复单元。根据8个位点的PCR产物电泳结果，81株Lp1型分离菌株分为19个MLVA型。通过PFGE和SBT方法，81株Lp1型分离菌株分别分为46种PFGE带型和21种ST型。结论MLVA方法的分型能力不及PFGE方法，而与SBT方法分型能力相当。但是，MLVA方法操作简单、成本低廉，而且可对培养阴性的标本进行分型，因此，该方法适合在基层推广应用。

军团菌；嗜肺军团菌；分子分型；MLVA

军团病主要是由嗜肺军团菌（Legionella pneumophila，Lp）感染引起的以肺部感染为主的疾病，其中，嗜肺军团菌中血清1型菌株（Lp1）引起的病例约占到80%左右［1］。已见报道的军团病暴发大多与环境水的军团菌污染关系密切［2］。因此，当军团病暴发以后快速确定污染的水源，对于控制疾病的蔓延具有非常重要的意义。然而，军团菌广泛存在于各种环境水中［3］，仅靠有无军团菌污染或简单的血清分型，不能准确地判断环境菌株和临床菌株间的相关性，而分子分型的方法能够在血清分型的基础上对菌株进行进一步的分型，其分析结果能更加准确地阐明环境菌株和临床菌株的关系。因此，军团菌菌株的分子分型方法在军团病暴发调查中得到了广泛的应用。

脉冲场凝胶电泳（Pulsed field gel electrophoresis，PFGE）和序列分型 （Sequence－Based Typing，SBT）是军团菌分子分型中常用的方法，这些方法具有重复性好、结果稳定、分辨力强等优点，目前已经成功应用于多起军团菌病暴发的调查中［4－5］。多位点可变数目串联重复序列多态性分析（Multiple Loci VNTR Analysis，MLVA）在许多病原菌的分型研究中都显示出良好的分型能力［6－7］，然而，该方法在军团菌分型中的应用很少。本研究采用MLVA分型方法，对我国环境水中分离的部分Lp1型军团菌菌株和2株参考菌株进行分子分型的研究，并与PFGE和SBT分型结果进行了比较，以探讨该方法在军团菌分型中的可应用性。

1 材料与方法

1．1 菌株来源 本研究采用的81株Lp1型军团菌菌株于2005—2008年分离自我国9个省市的环境水标本，其中，64株分离自集中空调冷却塔水，17株分离自温泉水，1株分离自生活用热水。2株参考菌株为ATCC33152和ATCC33153。

1．2 主要试剂与设备 Taq DNA聚合酶，d NTPs，Xba I酶购自Ta KaRa生物工程公司；50bp DNA Marker为Fermatas产品；PCR引物由北京华大基因公司合成；DNA提取试剂盒（QIAamp DNA Mini Kit）为德国QIAGEN公司产品；Asc I酶为美国纽英伦生物技术有限公司 （New England Biolabs，Ipswich， USA） 产 品。 比 浊 仪 为bio Mérieux DENSIMAT；PCR 扩 增 仪 为 Bio－Rad DNA Engine；脉冲场凝胶电泳仪为Bio－Rad CHEFDRIII system；凝胶成像仪为Bio－Rad Gel Doc XR。1．3 军团菌DNA制备 复苏冻存嗜肺军团菌菌株，挑取典型菌落传种于BCYE培养基，37℃，5%CO2培养过夜。菌株DNA提取按照试剂盒说明进行，提取的DNA置于－20℃保存备用。

1．4 MLVA 引物参照文献［8］，选取其中9个可变数目串联重复（Variable Number Tandem Repeat，VNTR）位点，序列见表1。PCR反应体系为：20μL总体积中含1×PCR缓冲液、0．2 mmol／L的d NTP、各0．5μmol／L的上下游引物、1U的Taq酶以及1μL DNA模板。PCR反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；72℃终末延伸5 min。PCR扩增中使用的Taq酶购自大连Takara公司。电泳条件为：2%的琼脂糖凝胶，3 V／cm，电泳3 h，在凝胶成像仪中读取片断长度。结果分析：由各位点PCR产物大小，确定串联重复序列重复数。PCR产物测序：针对每个位点不同长度的扩增片断，选取1－2株菌的PCR扩增产物进行测序，测序引物与扩增引物相同。重复检测：对所有研究菌株再次扩增，并采用已经测序的PCR产物作为分子量Marker，重新进行电泳和串联重复序列重复数读取。

1．5 PFGE 操作方法参考文献［9］。制备胶块的菌悬液浓度为3．8－4．0个麦氏单位，每个胶块用40 U Asc I酶37℃消化4 h。沙门菌Braenderup血清型菌株H9812作为分子质量标准，每块胶用40 U Xba I消化。脉冲场凝胶电泳条件为：电压梯度6 V／cm，电场夹角120°，电泳时间19 h，脉冲时间6．8－54．2 s。

1．6 SBT 参照文献［10］。①PCR反应体系为：50 μL总体积中含1×PCR缓冲液、0．25 mmol／L的d NTP、各0．2μmol／L的上下游引物、2 U 的Taq酶、0．5 U的高保真酶以及2μL DNA模板。②PCR反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃终末延伸5 min。③PCR产物测序：PCR产物交由TaKaRa公司和北京百泰克公司纯化和测序。④ST型的确定和分析：测序结果递交 “sequence quality tool”（http：／／www．ewgli．org），以检查测序质量，并获得等位基因序列号。

1．7 聚类分析 采用Bio Numerics（Version 5．10）软件 （Applied Maths，Kortrijk，Belgium）对分型结果进行聚类分析。

2 结 果

2．1 9个VNTR位点重复单元多态性 2株参考菌株的9个VNTR位点均能扩增出单一条带的PCR产物，各位点的重复单元拷贝数分别为8，8，11，2，4，17，1，1，3 和 8，8，10，2，5，15，4，1，14。81株分离菌株9个VNTR位点的等位基因型别数分别为6，3，4，2，3，3，2，4和7，其中部分菌株的某些位点无扩增产物或产物为非目的片断。各位点拷贝数见表2和图1。

2．2 不同位点重复单元的序列 9个VNTR位点中的7个位点PCR产物具有重复单元；Lpms3位点PCR产物无重复单元；Lpms31位点部分菌株PCR产物有重复单元，另一些菌株无重复单元。对无重复单元的序列进行Blast比对，结果显示，Lpms3位点PCR产物序列与数据库中军团菌VNTR位点吻合，而Lpms31位点PCR产物序列与VNTR位点以外的基因吻合。

对于具有重复单元的序列，不同菌株间以及同一菌株内各重复单元的序列变异均较大，Lpms1－b、Lpms3和Lpms31位点存在不完整的重复单元。

表1 MLVA引物序列和各位点重复单元长度Tab．1 Primer sequences and sizes of tandem repeats

表2 81株Lp1型军团菌菌株MLVA重复单元拷贝数Tab．2 VNTR sizes and copy numbers of 81 L．pneumophila isolates

2．3 81株Lp1型军团菌菌株 MLVA型 根据Lpms1－b、Lpms3、Lpms13、Lpms17、Lpms19、Lpms33、Lpms34和Lpms35等8个位点的PCR产物电泳结果，对菌株进行分型。2株参考菌株表现为不同的MLVA型，81株Lp1分离菌株分为19个MLVA型，其中，Lp．M11型别的菌株最多（n＝23），在7个省市均有发现且全部为冷却塔分离菌株，其次为Lp．M6（n＝13）。另外9种 MLVA型（Lp．M1，Lp．M4，Lp．M8，Lp．M10，Lp．M12，Lp．M13，Lp．M15，Lp．M16和 Lp．M18）也包含两个以上的菌株，除Lp．M12外，每种型别的菌株仅发现于同一个省市。3处温泉水分离的17株菌株分为7种MLVA型，各处型别无交叉；63株冷却塔分离菌株分为14种MLVA型，其中Lp．M6在温泉水也有分离，Lp．M8在生活热水中也有分离。5个分离位点（B4，B5，B6，S3和S8）发现2种以上MLVA型。所有MLVA型见表3。

2．4 与PFGE和SBT分型结果比较 81株Lp1型军团菌菌株分别分为46种PFGE带型和21种ST型。23株Lp．M11型菌株分为15种PFGE带型和5种ST型，其他菌株数较多的MLVA型（除外Lp．M13和Lp．M15）也能被PFGE和／或SBT进一步分型。具有相同PFGE带型或ST型的菌株也可被分为不同的MLVA型。MLVA和PFGE两种方法结合可将81株Lp1型军团菌菌株分为54种分子型别，MLVA和SBT两种方法结合可将这些菌株分为31种分子型别，3种方法的分型结果见图2。

表3 81株Lp1型军团菌菌株的MLVA型Tab．3 MLVA types of 81 L．pneumophila 1 isolates

3 讨 论

C．Pourcel［6，11］等对军团菌 VNTR 分型方法进行了较多的研究，本研究也是采用其挑选的VNTR位点进行分析，其中，Lpms37位点前期试验部分菌株没有扩增产物，而且重复单元太短（7～8 bp），普通的琼脂糖凝胶无法区分PCR产物长度，因此未用于本研究。根据报道［11］，Lpms31位点PCR产物太长（部分超过1 000 bp）且有大量的不完全拷贝，本研究还发现有些菌株的PCR产物序列与VNTR位点的基因序列不符合，因此该位点的电泳结果也未纳入最终分析中。

MLVA分型方法在许多病原菌的分型研究中都显示出良好的分型能力［6－7］。本研究中81株Lp1型军团菌菌株分为19个MLVA型，具有较好的多态性。鉴于本研究中部分菌株来自同一个分离地点，我国环境水中Lp1型军团菌菌株实际的多态性应该更高。通过比较，MLVA方法的分型能力不及PFGE方法，而与SBT方法分型能力相当。但是，MLVA方法操作简单、成本低廉，而且与SBT一样可对培养阴性的标本进行分型，因此，该方法适合在基层推广应用。对于重复单元较短的位点，PCR产物大小可能难以判定，这种情况下，可如本实验，对不同长度的PCR扩增片断进行测序，确定重复单元的拷贝数，并采用已经测序的PCR产物作为分子量Marker，对后期的PCR产物进行串联重复序列重复数读取。

图1 81株Lp1型军团菌菌株9个VNTR位点的多态性A：每个泳道为单一PCR产物。泳道1－6为Lpms1－b位点PCR产物、泳道7－9为Lpms3位点PCR产物、泳道10－12为 Lpms31位点 PCR产物、泳道13－18为Lpms35位点PCR产物。B：每个泳道为该位点所有长度的PCR产物混合物。泳道1－5依次为Lpms13、Lpms17、Lpms19、Lpms33和Lpms34位点Fig．1 Polymorphisms of 9 VNTR loci in 81 L．pneumophila 1 isolates（A）Single PCR product in each lane．Lanes：1 to 6，Lpms1－b；7 to 9，Lpms3；10 to 12，Lpms31；13 to 18，Lpms35；（B）Mix PCR product in each lane．Lane 1 to 6 was Lpms13，Lpms17，Lpms19，Lpms33 and Lpms34 in turn

Lp．M11型菌株在数量上具有明显的优势，而且在不同的省份均可发现，这一点对于军团病的暴发调查和环境水质的评价都是不利的。而PFGE和SBT可将这些菌株进行进一步的分型，因此，在需要的情况下可以将这两种方法与MLVA联合运用，以更加准确地进行军团菌分型和传染源判断。另外，从测序结果可以看出，不同菌株间以及同一菌株内各重复单元的序列变异均较大，因此，也可以结合重复单元的序列对菌株进一步分型。

一些研究报道，某些菌株的MLVA分型与地理分布有关［7，12］。本研究中，同样发现 MLVA基因型呈现明显的地理聚集现象，除Lp．M6、Lp．M11和Lp．M12型外，其他型别只在一个省份或分离地点出现，而同一地区内分离的菌株多具有相同的MLVA型。

图2 81株Lp1型军团菌菌株的MLVA型聚类分析Fig．2 Cluster analysis of MLVA types of 81 L．pneumophila 1 isolates

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Assessment on the application of multiple－locus variable－number tandem repeat analysis for Legionella subtyping

ZHU Bing－qing，REN Hong－yu，ZHOU Hai－jian，GUAN Hong，SHAO Zhu－jun

（State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control，National Institute for Communicable Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China）

To evaluate the applicability of multiple－locus variable－number tandem repeat analysis for Legionella subtyping，9 VNTR loci were selected to type 81 Legionella pneumophila serogroup 1 strains isolated from environmental water in China．There were 6，3，4，2，3，3，2，4 and 7 different products amplified from 9 VNTR loci respectively．No specific amplification was obtained from several loci of some strains．Repeated sequences were identified in PCR products of 7 loci．No repeated sequence was found in all sequenced products from locus Lpms3 and in some products from locus Lpms31．The sequences of tandem repeats varied within the same isolate as among isolates．Incomplete tandem repeats were found in 3 loci．Based on the polymorphisms of 8 loci，81 Lp1 strains could be classified into 19 types．Comparatively，these strains could be divided into 46 species and 21 molecular types by PFGE and SBT respectively．So，MLVA was less sensitive for Legionella subtyping．But it was easy and low－cost，and could be used in relatively simply equipped laboratories．

Legionella；Legionella pneumophila；molecular typing；MLVA

R183．3

A

1002－2694（2012）03－0256－05

＊“十一五”科技重大专项（2008ZX10004－007，2008ZX10004－008）

邵祝军，Email：shaozhujun＠icdc．cn

中国疾病预防控制中心传染病预防控制所呼吸道传染病室，北京 102206

2011－11－14；

2011－12－31