两种检测嗜肺军团菌方法的对比

付喜梅，黄庆华，俞秋华

（四川省疾病预防控制中心，四川成都 610041）

军团菌是一种可以引起急性细菌性呼吸道疾病（军团菌病）的细菌，且90%以上的军团菌病是因为感染嗜肺军团菌所致（Legionella pneumophila，Lp）[1]。嗜肺军团菌是革兰氏阴性菌，广泛存在于自然水体、人工水系统、空调冷却系统及沐浴用水中，可通过气溶胶的方式传播给人体[2]。目前，中央空调在公共场所中使用广泛，人工喷泉往往也在人口密集的场所，这些因素都会增加嗜肺军团菌的感染。因嗜肺军团菌生长周期长，营养要求严格，传统的细菌分离培养方法操作繁杂、阳性检出率较低，不利于公共环境的卫生监测，同时也不便于在临床普及应用[3]。因此，主要针对集中空调冷凝水中分离出的血清1型噬肺军团菌进行稀释培养和Legiolert定量盘检测。

1 材料与方法

1.1 试剂

GVPC选择培养基（北京陆桥），BCYE军团菌基础培养基（北京陆桥），军团菌诊断血清，Legiolert配套试剂，Legiolert定量盘。

1.2 仪器

371型 CO2恒 温 培 养 箱，Thermo ELECTRON CORPORATION；16824 型过滤器，Sartorius Biotech；DL30 型 水 浴 锅，Thermo SCIENTIFIC； Quant-Tray sealer plus型 Legiolert定量仪，IDEXX。

1.3 实验方法

本研究在2017年和2019年共采集冷却水样12份，依据WS394-2012《公共场所集中空调通风系统卫生规范》处理样品，将500 mL水样无菌操作进行过滤，取下滤膜并将其置于15 mL灭菌水中，充分洗脱，处理后进行接种培养及分离鉴定。随后取阳性菌株嗜肺军团菌血清1型用无菌水进行适当稀释，选择适宜稀释度悬液接种，吸取0.1 mL稀释液接种于GVPC平皿上并均匀涂布，做活菌培养计数，然后将培养皿放入 37 ℃的CO2培养箱培养7 d。Legiolert定量盘检测方法如下：取上述稀释度的悬液1 mL至含100 mL无菌水的不含硫代硫酸钠的无菌取样瓶中，后加入配套Legiolert试剂，盖上瓶盖，摇匀至试剂完全溶解。将处理好的样品全部倒入Legiolert定量盘中，轻拍或轻弹定量盘，以排出空气，然后立即放入Quanti-tray PLUS程控定量封口机中封口，取出定量盘并将纸板面向下于（37±0.5）℃培养箱培养7 d，同时设置阴性对照来判读结果，培养时需在培养箱底部放入托盘，内置一定体积的水，保证80%的湿度。

2 结果与分析

采集的12份冷却水中共检出嗜肺军团菌阳性2份，其中嗜肺军团菌血清1型1份，嗜肺军团菌2-15型1份。

分别取嗜肺军团菌稀释浓度为1∶107、1∶108、1∶109、1∶1010的稀释液0.1 mL接种在GVPC平皿上，在CO2培养箱培养第7 d的菌落计数结果分别为247 CFU、12 CFU、2 CFU、0 CFU。Legiolert定 量 盘检测方法培养不足7 d出现的阳性反应可以确定嗜肺军团菌检出，但准确的定量结果需要在第7 d读取。分别取嗜肺军团菌稀释浓度1∶107、1∶108、1 ∶ 109、1 ∶ 1010的稀释液 1 mL至100 mL的Legiolert试剂瓶中，封口后的定量盘培养第7 d时计数，稀释浓度分别为 1∶107、1∶ 108、1∶109、1∶1010，计数后查表检测浓度为 1 109 MPN、98.9 MPN、18.7 MPN、3.9 MPN。

3 讨论与结论

随着社会进步和公共设施的进一步完善，公共卫生检测工作应当引起更高的重视。在医院、酒店、地铁站等集中空调冷却塔水以及机场管道水、沐浴用水、景观水等公共场所均能分离出军团菌[4-8]。在这些水体系统中，冷却水中军团菌检出率相对较高[6,9-11]，嗜肺军团菌冷却塔的温度不仅适宜军团菌生长繁殖，且在系统循环过程中会形成气溶胶造成周围环境污染。军团菌在空气中以气溶胶的方式经呼吸道传播，引起军团菌肺炎或庞蒂亚克热[12]。因空调通风系统消毒不及时、使用维护不合理等原因，被军团菌污染的空调通风系统是造成室内空气污染和人员感染的主要来源。军团菌适宜生长温度是36～42 ℃，每年的夏秋季节随着气温升高，公共场所的空调使用也较频繁，冷却塔的水温会随之升高，这有利于军团菌的生长和繁殖，此时间段检测准确性较高。本研究在调查年份的6—9月采样，共抽取12家集中空调的冷却水，检出出2份嗜肺军团菌阳性，说明冷却塔水适宜嗜肺军团菌生长，需注意冷却塔水有引发军团病的危险，本次调查结果与多个空调冷却水、冷凝水军团菌污染调查结果一致[13]。军团菌病的预防主要是切断空调冷却水、景观水等水体系统中军团菌的污染源，常用的含氯消毒剂能有效杀灭军团菌但是长期使用对空调设备有损伤，因此有效且易实施的消毒方式对环境中军团菌的控制起着至关重要的作用。

军团菌是一种专性需氧的革兰氏阴性杆菌，其生长需要多种钙、镁、锰等元素，营养要求较高，实验室不易培养。分离培养法和Legiolert定量盘检测方法均可检出活菌存在与否，实验过程均能获得活菌用于后续研究。分离培养法是军团菌鉴定的金标准，特异性高达100%，但是该方法敏感性比较低，检出率为25%～75%，受实验室人员技术影响较大，且培养必须在CO2培养箱中进行[12-13]。Legiolert定量盘检测方法是基于酶底物反映的原理，通过与阴性对照组对比颜色和浊度的差异判断结果，7 d内实验组出现任何显褐色的迹象或者浊度大于阴性对照，均表明嗜肺军团菌阳性，即嗜肺军团菌检出。浊度大于阴性对照说明有嗜肺军团菌生长，但其中的指示剂还未显示出来。7 d内实验组出现阳性说明嗜肺军团菌检出，但定量结果需要在第7 d读取。Legiolert定量盘检测方法操作时间短，实验人员暴露风险降低，受实验人员技术影响较少，实验人员的日检测数量可以大幅度提高，无需二氧化碳培养箱，常规的培养箱即可达到培养条件。本研究中Legiolert定量盘检测方法初步实验结果中嗜肺军团菌检出范围为 3.9～2 272.6 MPN/100 mL，其中全部显褐色的检出结果为大于 2 272.6 MPN/100 mL，检测范围较大，适宜于采样液体量大但嗜肺军团菌含量低的样本，增加检测敏感性，提高检出率。该方法适用于生活饮用水和非饮用水中噬肺军团菌的检测，若用于冷却塔水检测时该方法在第7 d可以计数查表得到定量结果。对于嗜肺军团菌检出的场所，定量检测可以对消毒效果进行监测，指导公共场所卫生消毒工作。