旋转式细胞培养系统的原理及应用

来元亮

（上海奥尚生物科技有限公司，上海 200090）

细胞培养在整个生物技术工程中是一个必不可少的步骤，也是最核心、最基础的技术。旋转式细胞培养系统的出现使得细胞的培养过程更加顺利，效果也更符合人们的需求。本文分析细胞培养装置的现状，阐述旋转式细胞培养系统的概念，并介绍这一系统的作用原理、优势及应用。

1 细胞培养装置研究现状

虽然在目前已掌握的微生物技术中，工业培养微生物的技术已经发展得比较完善，但是这种微生物技术主要还是用于培养一些细菌以及藻类的蛋白质细胞。这类细胞的外层有牢固的细胞壁，生长所需的营养物质条件比较简单，属于容易培养的一类细胞。哺乳类动物细胞所需要的营养物质条件要求高，细胞大且脆弱，还不能进行游离生活，大多数要直接附着在某种哺乳类生物的细胞表面才能继续生长[1]。所以，就目前的细胞培养技术而言，大量培养哺乳类细胞是一个艰巨的任务。初期，研究人员通过微珠转瓶等方法来直接培养动物细胞，但是只能少量培养成功[2-3]。此后有研究者利用一种高密度的微载体细胞培养技术来直接培养更多的哺乳类细胞，利用微珠作为一种载体，使细胞直接生长在其表面。这种用微珠来培养细胞的方法一定程度上提高了哺乳类细胞的培养量[4-6]。但是随着哺乳类细胞的生长发育，细胞周围有利营养物质会逐渐减少，而排泄的垃圾和有害物质会逐渐增多。为了使生长的哺乳类细胞不断接触到有利的物质条件，通过分散和悬浮微珠，不断供给有利的物质条件并排出废液，以此来培养更多的细胞[7-8]。旋转式细胞培养系统的出现，使细胞培养的成活率逐渐升高，效率加快，已成为目前世界上最为理想的细胞培养装置[9-10]。

2 旋转式细胞培养系统简介

旋转式细胞培养系统（The Rotary Cell Culture System，RCCS）可以有效培养贴壁和悬浮的三维细胞，是目前已知世界上最为理想的细胞培养装置。这一系统最先出现在美国约翰逊航天中心，发明者最初的设计目的是为了保护在美国宇航局中进行纤细的组织培养。这种细胞培养系统能够用来培养其他不能轻易进行细胞培养的三维细胞和各种高密度的三维细胞。低剪切力、高化学物质能量传递效率以及微重力的独特培养环境是RCCS容器的独特培养特点，这种特点也使得研究者能够在普通的实验室中培养出三维的细胞组织。

目前已知有2种基本的RCCS细胞培养容器[11]：第一种是长圆柱形容器（STLV）（图1），容器呈管状，中央的气体交换膜芯是为了培养贴壁细胞而设计的；第二种是高精度截面纵横比细胞培养容器（HARV）（图2），这是一种盘状悬浮细胞培养容器，其内壁主要由氧交换细胞膜组成，是为了方便培养悬浮细胞而设计的。

图1 长圆柱形RCCS细胞培养容器（STLV）

图2 高精度截面纵横比细胞培养容器（HARV）

3 RCCS的工作原理

旋转式细胞培养系统主要由同轴旋转的氧化器和细胞培养皿组成。系统工作时，培养皿内部已经充满了大量培养基，且这些培养基可以像固体一样紧紧围着水平轴进行转动。在这一过程中，培养基均以相同的角速度转动，使得培养皿内产生层流并具有最小的剪切力；培养系统内的细胞由离心力、重力以及科式力共同作用而变成悬浮状态。所以在RCCS培养系统内的细胞不仅受到最小的机械外力，还能够得到最充足的营养以及氧气等必备物质，因此而聚集形成了类组织聚合物。在旋转式细胞培养系统内，悬浮的细胞可以产生一个液体悬浮轨道；而随着细胞的不断生长，研究者可以随意调节旋转速度，以此来抵偿沉降速率[12]。

4 RCCS的优势

在RCCS的液体培养过程中，培养基中的各种液体培养物质都随着RCCS容器在电机驱动作用下沿细胞的水平轴方向旋转[13]。在细胞的水平轴内，细胞颗粒可以很容易地建立起一个细胞悬浮轨道，使得细胞培养基以及细胞颗粒都会随着培养系统一起旋转，而这些细胞颗粒又不会与培养容器壁或其他生物体相互接触或碰撞；加上培养系统内部没有其他外力，使得细胞或者组织在生长过程中受到的破坏性影响降至最低。在此培养系统中，通过气体交换器，细胞或者组织的气泡能够直接吸入大量氧气并排出二氧化碳[14]。另外，由于RCCS培养器有很好的物质交换功能，因此细胞能够在RCCS中以很高的密度生长，细胞组织的生物体培养细胞密度大约为107～1011个细胞/mL；其细胞的培养密度大约为107。所以到目前为止，几乎所有的生物体细胞组织都已经能够通过RCCS培养系统进行培养。具体分析，RCCS培养器主要有以下4方面优势：

（1）利用RCCS培养器培养细胞能够为细胞提供良好理想的环境，与动态和静态组织培养环境相比，更加接近体内的生长环境，能够允许细胞聚焦、三位分化以及生长。

（2）在利用动态的培养系统时，由于悬浮的作用，细胞组织会与推进器接触，从而使其受到损伤；在处于静态的培养装置中，二维的环境可能会改变基因的表达和组织细胞的分化，因此这两种均不是理想的培养系统。而与这两种培养系统的功能相比，RCCS培养系统的结构和功能较为理想。一些细胞或者组织在RCCS培养器中，会因为随机变化的重力矢量而悬浮，从而使组织在整个培养液中处于自由落下的随机生长状态[15-16]。组织在培养液中自由地落下、翻滚并相互混合，不会受到任何一个细胞生长方向的单个细胞重力矢量的相互影响，因此可以向各个细胞生长方向自由地生长[17]。这是目前RCCS培养系统所表现出来的不同于其他两种培养系统的特点和优势，也是这种培养系统能够成为最为理想的培养装置的一个重要原因。

（3）在旋转式细胞培养系统中，没有推进器、空气升液器等外力因素，使得细胞受到的破坏力减至最小。细胞都维持在一个较为适合生长的轨道中，因此能够共同生长，从而形成一种三维式结构。

（4）旋转式细胞培养系统是目前世界上唯一一种能使研究者进行共同培养的系统。这种培养方法能够使高细胞增殖，降低细胞死亡率，并增加细胞的分泌产物。

如表1所示，为旋转式细胞培养系统与其他培养方式的对比[18]。

5 RCCS的特点

5.1 高分化度

旋转式细胞培养系统使得高分化的人体组织能够在实验室中培养，从而培养出与人体器官相类似的细胞。

5.2 很好地模拟微组织重力

在目前传统的微重力培养方式中，研发者一般都需要在体内的外部环境中很好地模拟正常细胞组织生长的过程和环境。但是由于细胞外的基质太复杂，且培养的细胞难以很好地适应其在细胞外的正常生长环境，所以在正常培养的细胞生长过程中很难获得成功。但是细胞外的基质对于研发者调节细胞骨架和促进细胞核机制蛋白的正常培养可能会起到至关重要的促进作用，因此RCCS系统可以解决由于分裂而本来应在一起的细胞组织的重力问题，从而能够很好地模拟体内的环境，改善传统培养方式的不足[18]。

5.3 三维细胞培养

在普通的三维生物化学反应器中，细胞要长期保持三维细胞的正常悬浮和流动状态，导致细胞间极有可能产生剪切力，影响了三维细胞间的稳定，使得组织和三维细胞的注意力集中于自身的修复，从而对其生长和发育产生了很大的影响[13]。发酵罐主要是用来储存和培养大量的三维细菌，并不特别适合哺乳动物细胞以及其他动物组织的三维细胞培养。因此，把众多的三维细胞直接移植至发酵罐中，只能保证很低的细胞成活率。而旋转式发酵罐培养系统能够很好地允许大规模的细胞生产，细胞平均成活率最低能达到97%，且细胞分化的速度还极高。

6 RCCS的应用

目前，大型旋转式体外组织培养系统已被广泛应用于临床生物医学等各个领域。这种大型旋转式体外组织培系统不仅可以直接用于人工生成各种大型高仿和逼真的体外体内组织培养模型，还可以直接用于人体进行长期的体外组织培养，被广泛应用的培养场景主要有以下9种[18]。（1）疫苗生产。RCCS培养的肝在欧洲和美国已广泛地应用于生产，使其可以代替成为人的肝脏成为现实；（2）组织移植。用旋转式培养系统培养的某些人体组织已经和自然状态下的组织在整体上无差别，所以这种培养技术使得局部组织的移植成为可能。（3）细胞软骨关节再生。经RCCS细胞再生系统复制和培养的细胞软骨密度极高，可有效治疗软骨关节损伤。（4）骨髓再生。经RCCS培养的骨髓生长状况极佳，可依靠该方法建立大型骨髓库，使更多的人受益。（5）分化性皮肤培养移植。经过该系统培养的皮肤分化程度极高，弥补了以前的培养系统的一些不足之处，为那些需要及时进行皮肤移植的人们和患者带来了福音。（6）有效杀灭肿瘤。（7）肿瘤等病症的理想模型。

表1 各种培养系统的对比

7 结语

旋转式细胞培养系统虽然为细胞的培养提供了理想的装置，但是还存在一些不足之处，如仪器的使用成本较高，使用前的仪器消毒也比传统的方法复杂。但是，这种培养系统依旧具有很好的发展前景，值得进行深入研究和广泛应用，并为人类的发展以及进步做出贡献。