探针熔解分析法快速检测结核分枝杆菌链霉素耐药突变

陈春辉

(九江市第三人民医院检验科，江西 九江 332000)

探针熔解分析法快速检测结核分枝杆菌链霉素耐药突变

陈春辉

(九江市第三人民医院检验科，江西 九江 332000)

目的对采用探针熔解分析法对结核分枝杆菌的链霉素耐药突变情况进行快速检测的应用价值进行研究分析。方法抽取740株结核分枝杆菌的临床分离菌株，采用探针熔解分析法，对链霉素耐药突变情况进行检测。结果740株结核分枝杆菌中有86株发生突变，9份标本中发现杂合信号，8份标本中没有任何信号。29份存在药敏性的标本的检测结果均显示为野生型，有耐药性的13份标本中仅有5份存在突变现象，另外的8份标本检测结果显示为野生型。结论采用探针熔解分析法对结核分枝杆菌的链霉素耐药突变情况进行快速检测，其特异性非常明显，且具有快速、准确的特点。

探针熔解分析法；结核分枝杆菌；链霉素；耐药突变

为了对采用探针熔解分析法对结核分枝杆菌的链霉素耐药突变情况进行快速检测的应用价值进行研究分析，使临床对对结核分枝杆菌的链霉素耐药突变情况有更加全面的了解，为临床提供对对结核分枝杆菌的链霉素耐药突变情况进行检验的有效方法，使该项检测方法在临床上得到进一步的普及和应用，我们组织进行了本次研究。在研究的整个过程中，我们抽取740株结核分枝杆菌的临床分离菌株，采用探针熔解分析法，对链霉素耐药突变情况进行检测。现将分析结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

抽取在2008年5月至2011年5月这三年时间内收集的740株结核分枝杆菌的临床分离菌株。野生型标本选用H37Rv标准株，标准菌株盘采用特异性实验所用的包含37株非结核分枝杆菌的标准盘。

1.2 仪器

我院现有的普通PCR仪和实时PCR仪。

1.3 方法

采用试剂盒中所提供的提取液制备所需的PCR扩增模板。具体的步骤包括以下几点:用接种环对固体培养基上的结核分枝杆菌进行收集，使其悬于剂量为300μL提取液中。取1mL液体液体培养基上的结核分枝杆菌，在10000r/min的条件下进行离心处理15min左右，将上清丢弃后在300μL的提取液中对细菌进行重悬处理。采用封口膜进行封口，99℃条件下加热处理20min左右，然后在14000r/min条件下离心处理10min左右，将上清液移至1.5mL的离心管内。即为PCR的扩增模板，要采用紫外检测方法对模板的浓度进行定量，结核杆菌含量在103拷贝/μL以上。使用之前在-20摄氏度环境中保存[1]。

1.4 数据处理

在本次研究过程中所得到的所有相关数据，均采用SPSS14.0统计学数据处理软件进行处理分析，P＜0.05时认为有明显的统计学差异。

2 结 果

经过仔细研究后我们发现，740株结核分枝杆菌中有86株发生突变，9份标本中发现杂合信号，8份标本中没有任何信号。29份存在药敏性的标本的检测结果均显示为野生型，有耐药性的13份标本中仅有5份存在突变现象，另外的8份标本检测结果显示为野生型。

3 讨 论

常规的一些抗结核类药物是目前临床对患有结核病的患者进行化学药物治疗的一个基本方法，而对该类采用化学药物进行治疗是对目前我们对结核病进行有效控制的一种非常重要的手段。链霉素是在上个世纪的40年代被医学界所发现的，是截止到目前为止，临床上公认的出现最早的对结核患者进行治疗的药物，同时该药物也是目前对患有结核病的患者进行治疗一种常规药物。链霉素是一种比较常见的氨基环醇糖苷类抗生素药物，该药物在服用后主要会对结核分枝杆菌的核糖体产生作用，与核糖体上的30S亚单位发生特异性的结合反应，诱导相关的遗传密码产生错配效应，对mRNA翻译整个进行过程产生一定的抑制效果，对翻译的校对过程也具有一定的干扰效果，从而对整个蛋白质合成过程进行有效抑制。链霉素在临床对结核病患者进行治疗的过程中，通常采用单独给药方式，因此该药物的耐药性的发展速度非常快。

由于贫困、艾滋病、人口流动过快和机体耐药等因素的影响，目前全球范围内结核病的发病率和病死率正呈现出一种快速回升的发展态势，已经成为了临床上与艾滋病对人类具有同等危害性的全球性的最危险的一种传染病。由于结核分枝杆菌的生长速度比较缓慢，经增菌培养处理后再进行药物敏感性试验，通常情况下需要6周左右的时间，因此，对临床上常见的一些自身具有非常强的耐药结核病的患者进行治疗的过程中，无法提供一些更加及时的指导，使临床实际治疗过程中的需要很难得到充分的满足，因此尽快找到一种对结核分枝杆菌的耐药性进行快速检测的实验方法是一个亟待解决的问题。近年来，通过不断地研究已经找到了一些能够分子的水平对基因突变的具体情况进行准确检测的方法，例如单链构象多态性分析法（SSCP），限制性片段长度多态性分析法（RFLP），DNA测序法，线性探针杂交法等，这些方法与前面所说的培养方法相比较，这些方法的检测速度更快，能够一定程度上使检出率和通量得到提高，但是均需要进行PCR后处理， 这不仅会对检测的效率造成一定的影响，更容易将已经扩增的产物污染，而且在操作过程中的难度也会随之加大，对实验室的仪器设备的实际要求会非常高。从这一点来讲，实时荧光PCR技术所具有的优势就非常明显。首先，进行实时扩增处理时的检测优势会相对更大一些，可以从根本上进一步缩短检测所需要的时间。在本次实验研究进行的整个过程中，对单个的样品进行检测所需的时间仅为2h左右;省去了PCR的后处理的相关步骤，进而进一步降低了样品在检测过程中被污染的机会;同时还有PCR的高效、快捷、简便、经济等一系列优点，可以对结核分枝杆菌的链霉素耐药的突变情况的多个相关基因进行检测，适用于临床对大批量的菌株进行筛查[2]。

总而言之，采用探针熔解分析法对结核分枝杆菌的链霉素耐药突变情况进行快速检测，其特异性非常明显，且具有快速、准确的特点，可以将该项检测技术直接应用于临床检测过程中。

[1]王超,朱中元.抗结核病药物的研究进展[J].中国热带医学,2008,18(14):674-675.

[2]王甦民.应重视结核病的实验诊断[J].中华医学检验杂志,2005,28(18):769-770.

R378.91+1

B

1671-8194（2012）14-0088-02