野生猕猴STLV-1和B病毒抗体的检测

李常挺 ，盘宝进 ，谢永平 ，李 军 ，陈泽祥 ，杨 威

（1.隆安县动物疫病预防控制中心，广西隆安 532700；2.广西出入境检验检疫局国家灵长类实验动物检测重点实验室，广西南宁 530021；3.广西兽医研究所，广西南宁 530001；4.广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁 530001）

广西地处亚热带，特别适合于猕猴生长繁殖，多个自然保护区内繁衍有野生猕猴，广西从未对野生猕猴T淋巴细胞白血病病毒1型（STLV-1）、猕猴疱疹病毒I型（B病毒）和免疫缺陷病毒3种病毒进行过抗体检测。2012年2月23日，接到某自然保护区报告，有1只野生猕猴发病濒临死亡，应保护区要求，对发病现场进行了调查，抽取血液分离血清，对死亡病猴剖检观察记录病变情况，采集脏器实验室分离细菌，检测血清样品中猴3种主要病毒的抗体，现报告如下。

1 发病经过及临床检查

2月23日上午，工作人员在自然保护区内进行定期线路巡查监测，发现有1 只母猴精神沉郁，走路摇摆不定、单只落伍，随后该猴倒地不能行走。将该猴装入铁笼内带回管理处作进一步观察，猴病情进一步恶化，精神极度萎靡，两眼目光呆滞，现场测体温，已经降至35℃。经体表诊查，眼角无结屎和流泪，四肢及腹下无明显疹块，口腔黏膜、舌和唇部无痂皮病变，肛门无结粪或拉稀等现象。

2 血样采集

保定使猕猴侧卧，无菌从心脏采集血液，静置30 min，3 000r/m离心后，收集上层血清于1.5 mL离心管，冻存备检。

3 剖检

两侧肺脏病变不一致，左侧肺脏轻微萎缩，右侧肺尖叶有出血，轻度坏死，肌肉及皮下未见有出血点，腹股沟浅淋巴结无肿大和出血，肝、脾、肾未见异常，肠道粘膜无充血和出血，心包无积液，心肌未见出血点。无菌采淋巴结、脾、肺、肝脏等组织样品送实验室作细菌分离培养。

4 细菌分离培养

无菌取淋巴结、肝、脾、肺分别接种营养肉汤和血琼脂平皿培养基，37 ℃培养24 h，均未见细菌生长。

5 猴三种主要病毒血清抗体检测

5.1 设备、试剂和材料

5.1.1 设备 恒温培养箱或水浴锅、摇床、震荡器、可调移液器、电子分析天平（精度0.1 mg）。

5.1.2 试剂 猴T淋巴细胞白血病病毒1型（STLV-1）斑点酶免疫检测试剂盒、猕猴疱疹病毒I型（B病毒）斑点酶免疫检测试剂盒、猴免疫缺陷病毒（SIV）斑点酶免疫检测试剂盒，均由美国VRL实验室中国分公司生产。

5.1.3 待检猴血清样品。

5.2 实验操作

STLV-1、B病毒和SIV三种病毒抗体检测分别按试剂盒操作说明进行检测，主要操作程序如下。

5.2.1 血清稀释 样品和阴性、阳性血清作1:5稀释。

5.2.2 准备膜 取出抗原膜，编号后加入15mL样本稀释液，置摇床上慢速摇动，室温封闭半小时，结束后PBS洗涤三次。

5.2.3 贴膜 用尖头镊子轻夹一片小滤纸条，将一端小心浸入样品稀释液中待纸条吸附上液体后提出液面，并将纸条在试管口轻刷1~2次，去掉多余的液体，然后贴覆在抗原膜上用吸水纸吸干镊尖，再贴下一个样本。

5.2.4 孵育 每张膜贴好后，于37℃孵育30 min。

5.2.5 洗涤 取出洗涤三次，每次5 min。

5.2.6 酶标二抗 加入酶标二抗于室温孵育30 min。

5.2.7 洗涤 取出洗涤三次，最后一遍把液体尽可能控干。

5.2.8 显色 取显色剂A和显色剂B，将两种显色剂混合倒入平皿中，待阳性对照点出现明显的红色时即可终止反应。

5.2.9 终止 将染好的膜放入预先准备好的终止液中1 min，然后用蒸馏水快速洗涤两遍。将膜置于空气中自然晾干。

5.3 结果判定

5.3.1 阳性结果判定 对照细胞点无色或颜色很淡，阳性对照点呈红色，若样品病毒抗原点呈红色，则判为阳性。

5.3.2 阴性结果判定 对照细胞点无色或颜色很淡，阳性对照点呈红色，若样品病毒抗原点无色，或颜色很浅且与相应对照细胞点接近，则判为阴性。

5.4 检测结果

分别用猴T淋巴细胞白血病病毒1型（STLV-1）、猕猴疱疹病毒I型（B病毒）和猴免疫缺陷病毒（SIV）斑点酶免疫检测试剂盒检测野生猕猴血清中STLV-1、B病毒和SIV抗体，猴血清中STLV-1和B病毒抗体呈阳性，SIV抗体呈阴性。

6 小结

对广西某自然保护区发病的野生猕猴进行临床检查、剖检、采集脏器作细菌分离培养、临床检查未见有特征性变化，剖检仅见右侧肺尖叶有出血，左侧肺脏轻微萎缩外，其它脏器未见典型病变，从脏器组织也未分离出致病性细菌，初步排除细菌性传染病。

经检测感染猴3种主要病毒性疾病的血清病毒抗体，猴T淋巴细胞白血病病毒1型（STLV-1）和猕猴疱疹病毒I型（B病毒）抗体均为阳性，猴免疫缺陷病毒（SIV）为阴性。STLV-1属于C型逆转录病毒，与非人灵长类动物的T淋巴白血病和淋巴肿瘤有关，其主要传播方式是通过血液传播[1]，可能与部分猕猴的恶性肿瘤有关。猴B病毒是猕猴疱疹病毒I型，猕猴感染B病毒后常无明显的临床症状，有些可引起牙龈炎、结膜炎和口腔及生殖器官感染，之后可转为慢性感染。但在受到刺激，抵抗力下降或自发再激活时，可在唾液或生殖道分泌物中排毒。猴之间的传播主要以密切接触、抓咬和性活动为主。同时，猴B病毒为人兽共患病，B病毒可以通过带毒病猴咬伤而使人感染，被咬局部发生红、肿、热、痛、疱疹和淋巴管炎及淋巴结炎，最后出现上行性脊髓炎，因此防范B病毒的感染具有重要的公共卫生学意义[2-4]。

病猴血清中STLV-1和B病毒抗体为阳性，说明猕猴感染过这两种病毒。由于条件有限，未能进行结核病、流感病毒等其他更多的病原检测，引起该猕猴死亡的原因是否是STLV-1或B病毒，有待进一步证实。

[1] 张利仙，陈朝银，艾军，等.猴嗜T淋巴白血病病毒研究进展[J].中国畜牧兽医，2011，38（2）：174-177.

[2] 张振兴，沈永林.动物园动物疾病[M].北京：中国农业出版社，2009：245-246.

[3] 田克恭，蔺会云，遇秀玲，等.PCR在猴B病毒鉴定中的应用研究[J].中国实验动物学报，2001，9（4）：213-215.

[4] 尧黄印，翁玉麟.福建野生猕猴B病毒感染情况调查[J].畜牧兽医杂志，1991（4）：15-16.