不同毒力结核分枝杆菌感染小鼠对肺泡巨噬细胞的凋亡率及其时相性变化的影响①

董江涛 徐 芳 田玺择 姚 楠 吴 芳 章 乐 王远志 曹旭东 张万江

(石河子大学医学院免疫学教研室/石河子大学新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子832002)

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一种世界性传染病，也是单一致病菌感染导致死亡率最高的感染性疾病。结核分枝杆菌感染人体后，主要被宿主巨噬细胞吞噬，未被机体免疫系统清除而潜伏下来的结核分枝杆菌，主要在宿主巨噬细胞内存活和繁殖［1］。因此对不同毒力的结核杆菌感染的不同时期机体免疫细胞凋亡率的研究，可为深入了解结核病的免疫发病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明种小鼠，6～8周龄，体重(18±2)克，雌雄各半，共80只，购自石河子大学实验动物中心。

1.2 菌株 结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株和卡介苗菌株购自中国药品生物制品检定所。

1.3 主要试剂与仪器设备 Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(美国Biovision公司)、流式细胞仪 、生物安全柜、激光共聚焦显微镜、Mycobacterium tuberculosis 16 kD antibody(只针对结核分枝杆菌的16 kD的小鼠单克隆抗体)、FITC荧光二抗(山羊抗小鼠)。

1.4 实验分组 将实验小鼠随机分为结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株组和卡介苗菌株组，每组按感染模型复制成功后 1、3、5、7、9、11、13、15天设置8个时间点，每个时间点各设5只小鼠，每种菌株组为40只小鼠。

1.5 小鼠感染模型建立及鉴定 在生物安全柜内，以灭菌接种环取改良罗氏固体培养基上生长2～3周状态良好的结核分枝杆菌菌落，置灭菌磨菌器中，加少量0.05%Tween-20的生理盐水充分研磨，使其成均匀浑浊的菌悬液。麦氏比浊法调细菌浓度约1.0×107个/ml。将不同菌悬液经小鼠尾静脉分别注射到对应分组的每只小鼠体内，注射量约为0.3 ml。感染小鼠置生物安全三级实验室内，IVC笼具中饲养。

1.6 小鼠肺泡巨噬细胞的收集 方法参照文献［2］并加以改进，在上述不同时间点，将小鼠脱颈处死，经眼后放血，暴露支气管，用消毒好的剪刀在气管上做一切口(切勿剪断)，用连有注射器的无菌软皮管从切口处插入气管，丝线固定，用4℃预冷PBS液行气管肺泡灌洗，每次1 ml，共10次，离心管收集支气管肺泡灌洗液，4℃ 1 500 r/min离心10分钟，弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，转入细胞培养瓶中。置37℃、5%CO2孵箱中培养4小时，贴壁细胞即为小鼠肺泡巨噬细胞。

1.7 激光共聚焦显微镜观察各组小鼠肺泡巨噬细胞

1.7.1 细胞爬片 收集小鼠肺泡巨噬细胞，用10%胎牛血清的DMEM培养液重悬，将细胞悬液均匀铺到六孔板(内置预先灭菌处理过的盖玻片)中，置于37℃、5%CO2孵箱中培养4小时。

1.7.2 细胞固定 取出盖玻片，用PBS侵洗，然后放入4%多聚甲醛固定液中室温下静置固定15分钟，蒸馏水冲洗3次。

1.7.3 固定好的细胞玻片放入湿盒中，滴加山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体，勿冲洗。

1.7.4 滴加稀释后的一抗(稀释度1∶1 500)，均匀铺在玻片上，湿盒内放置，4℃过夜。

1.7.5 PBS冲洗3分钟，3次，滴加荧光二抗(稀释度1∶500)，室温2小时，PBS冲洗干净，硝酸甘油封片。

1.7.6 激光共聚焦显微镜观察荧光强度及着色部位。

1.8 应用流式细胞技术检测各组、各时间点小鼠肺泡巨噬细胞凋亡 按照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒的说明操作：按上述方法获得细胞培养瓶内培养4小时的贴壁小鼠肺泡巨噬细胞，倒掉上清液，加入PBS洗涤一次，用胰酶消化使贴壁细胞悬浮，1 000 r/min离心10分钟，弃培养基。用500 μl 1×Binding Buffer悬浮肺泡巨噬细胞。在细胞悬浮液中加入5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2℃ ～8℃避光条件下孵育15分钟。加入10 μl PI后轻轻混匀于2℃ ～8℃避光条件下孵育5分钟。在1小时内用流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 应用激光共聚焦显微镜观察各组感染小鼠肺泡巨噬细胞 感染小鼠肺泡巨噬细胞内结核分枝杆菌膜上的小分子热休克蛋白Hsp16.3与一抗(只针对结核分枝杆菌的16 kD的小鼠单克隆抗体)结合，再与FITC(绿色荧光)标记二抗结合。在激光共聚焦显微镜下，结核分枝杆菌H37Rv菌株和BCG菌株感染的小鼠肺泡巨噬细胞内均可见大量绿色荧光(见图1和图2)，表明结核分枝杆菌H37Rv菌株和BCG菌株被小鼠肺泡巨噬细胞大量吞噬。

2.2 利用流式细胞技术检测 结核分枝杆菌H37RV株和BCG菌株分别感染小鼠后，各感染组小鼠肺泡巨噬细胞凋亡结果见图3，H37Rv和BCG菌株感染组均出现巨噬细胞的凋亡率逐渐升高至第9天时达到最大的变化趋势，见表1。

图1 BCG菌株感染小鼠肺泡巨噬细胞激光共聚焦显微镜检测结果(×400)Fig．1 BCG strains of mice infected identification copied，and extracted mouse alveolar macrophages in the co focal microscope morphology(×400)

图2 结核分枝杆菌H37Rv菌株感染小鼠肺泡巨噬细胞激光共聚焦显微镜检测结果(×400)Fig．2 Infected with Mycobacterium tuberculosis H37Rv strains of mice identification copied，extracted mouse alveolar macrophages in the co focal microscope morphology(×400)

图3 结核分枝杆菌H37Rv和BCG菌株分别感染小鼠肺泡巨噬不同时间点细胞流式细胞术的检测结果图Fig．3 The results of flow cytometry detecting mouse alveolar macrophages infected by M．tuberculosis H37Rv and BCG strain at different time points

表1 H37Rv组和BCG组小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率(n=5，%，±s)Tab．1 The apoptosis rate of Mouse alveolar macrophages at different time，in group H37Rv and BCG(n=5，%，±s)

表1 H37Rv组和BCG组小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率(n=5，%，±s)Tab．1 The apoptosis rate of Mouse alveolar macrophages at different time，in group H37Rv and BCG(n=5，%，±s)

Time(d)H37Rv group BCG group 1 1.68±0.28 0.60±0.09 3 6.46±0.39 0.84±0.22 5 7.19±0.34 1.63±0.97 7 12.80±0.56 1.49±0.77 9 17.41±0.68 2.49±0.72 11 12.61±1.53 1.13±0.99 13 3.38±1.28 1.16±0.28 15 2.23±0.18 0.57±0.12

3 讨论

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一种世界性传染病，也是单一致病菌感染导致死亡率最高的感染性疾病。结核病的致病菌——结核分枝杆菌是典型的胞内致病菌，主要在巨噬细胞等宿主免疫系统的细胞内存活和繁殖，但目前机体抗结核的免疫机制尚不清楚，有待进一步的探索和研究。

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白(sHSPs，small heat shock proteins)HSP16.3是近年研究发现的结核分枝杆菌中一个存在于膜上的主要抗原蛋白，一个组成性表达蛋白，正常条件下有少量表达，在结核分枝杆菌被宿主巨噬细胞吞噬后进入静止生长期时结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16.3显著表达［3］，本实验首先通过感染小鼠肺泡巨噬细胞内结核分枝杆菌膜上的小分子热休克蛋白HSP16.3与一抗(只针对结核分枝杆菌的16 kD的小鼠单克隆抗体)特异性结合，再与FITC(绿色荧光)标记二抗结合，在激光共聚焦显微镜下观察，可见结核分枝杆菌H37Rv菌株和BCG菌株感染的小鼠肺泡巨噬细胞内均有大量绿色荧光，证明H37Rv菌株和BCG菌株通过尾静脉进入小鼠体内可被肺泡巨噬细胞大量吞噬。然后通过流式细胞技术检测结核杆菌国际标准强毒力株H37Rv感染组和BCG感染组的巨噬细胞凋亡率，均呈现出1～9天内的逐渐升高，至9天时最高，分别为17.41%和2.49%，9天以后，凋亡率逐渐降低的趋势，结核分枝杆菌标准强毒株H37Rv株感染组巨噬细胞的凋亡率明显高于 BCG感染组，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。由此可见，结核分枝杆菌感染宿主后，主要被宿主巨噬细胞吞噬，未被机体免疫系统清除而潜伏下来的结核分枝杆菌，也主要寄生于宿主巨噬细胞内。宿主巨噬细胞在结核分枝杆菌与宿主相互作用的过程中具有重要作用，结核分枝杆菌感染的后果以及结核病的发生与否与宿主巨噬细胞密切相关。宿主巨噬细胞发生凋亡后，可杀死寄生于其内的结核分枝杆菌，阻止结核分枝杆菌在体内的播散，并能激活邻近未感染的巨噬细胞，增强机体对结核分枝杆菌的杀伤能力。因此，巨噬细胞的凋亡情况对于寄生于其中的结核分枝杆菌的命运至关重要。结核分枝杆菌要想成功地在宿主巨噬细胞中存活，就必须通过某些机制对宿主巨噬细胞的凋亡进程进行干预和调控，这有待于进一步探讨和研究。

在结核分枝杆菌感染的过程中，结核分枝杆菌与宿主巨噬细胞相互作用及相互适应，可调控宿主巨噬细胞的凋亡。目前关于结核分枝杆菌干预和调控巨噬细胞凋亡的途径和机制尚不清楚，在结核菌感染的早期巨噬细胞凋亡率不高，可能是由于巨噬细胞大量地凋亡将不利于巨噬细胞提呈抗原，机体主要通过这段时间建立有效的抗结核细胞免疫效应。随着机体免疫效应的建立，巨噬细胞通过自身的凋亡达到杀死和清除结核分枝杆菌的目的，结核菌感染宿主巨噬细胞凋亡率逐渐升高，最终达到顶峰［4］。结核分枝杆菌可诱导巨噬细胞凋亡的同时，也具有抑制巨噬细胞凋亡的作用，当这两种作用达到平衡时，结核分枝杆菌则以休眠状态存在于巨噬细胞中，形成所谓的“逃避”，使自身的存活、繁殖与宿主的一系列免疫反应达到一种动态平衡［5］，因此，结核病的发生与发展过程中，时刻伴随机体免疫细胞的凋亡是机体与结核分枝杆菌之间相互斗争的结果。对结核分枝杆菌与宿主巨噬细胞调控作用的机制研究，为阐明结核病的发病机制奠定基础。

1 Metro G，Saba A，Gupta T D et al.Chaperone-mediated inhibition of tubulin self-assembly［J］.Proteins，2007;67(1)：112-120.

2 陈秀芳，金丽琴，吕建新et al.蝉拟青霉对大鼠腹腔及肺泡巨噬细胞的激活作用［J］.中国病理生理杂志，2002;18(6)：694-697

3 Fu X，Chang Z.Identification of a highly conserved pro-gly doublet in non-animal small heat shock proteins and characterization of its structural and functional roles in Mycobacterium tuberculosis Hsp16.3［J］.Biochemistry(Mosc)，2008;71(Suppl 1)：S83-S90.

4 Keane J，Remold H G，Komfeld H.Virulent mycobacterium tuberculosis strain evade apoptosis of infected alveolar macrophage［J］.J Immunol，2000;164(4)：2016-2020

5 Rengarajan J，Bloom B R，Rubin E J.Genome wide requires for Mycobacterium tuberculosis adaptation and survival in macrophages［J］.Proc Natal Aced Sic USA，2005;102(23)：8327-8332.