低氧对神经干细胞增殖及分化的影响

杜 娟， 陈 立， 陈 丽综述， 吕晓红审校

神经干细胞(neural stem cells，NSCs)是近年来治疗神经系统疾病颇具前景的基因工程细胞，尤其是在神经功能修复方面，具有重要的科学意义及社会应用价值。对于神经功能损伤的治疗，目前仅限于内科药物治疗及外科手术干预，但对于已经丧失的神经功能的恢复和重建，这些治疗措施都无根本性疗效。而神经干细胞的研究和发展为解决这一问题提供了重要的途径和手段，成为研究的热点。但神经干细胞移植目前仍处于动物实验阶段，究竟是什么制约这一研究的进展呢?众所周知，神经干细胞首先要在移植体内存活，才能发挥作用。大量的动物实验表明，在被移植入损伤区后，神经干细胞的存活、增殖、分化以及迁徙过程均受到局部复杂微环境等因素的影响，特别是脑血管疾病中缺血缺氧的局部微环境，这是制约干细胞移植的瓶颈之一。随着对这些问题认识的不断深入和研究的不断进展，到目前为止的证据表明干细胞疗法的继续发展，最终可能成为缺血性脑损伤可行的治疗选择。

1 氧浓度是神经干细胞微环境中的重要组分

自我更新和多能性是干细胞的特性，而这种特性与干细胞所处环境中各种因素的平衡密切相关，该环境称为微环境，早在1978年Schofield就提出了这一概念，即细胞、细胞间质及影响细胞生长的各种因素组成的复杂而统一的环境，微环境中的任何因素发生变化，都会转化成一定的信号进而影响细胞。其中包括传统认识中的培养基成分、营养因子、pH、氧浓度等，特别是氧气浓度成为一直以来研究的热点，被认为是微环境中非常重要的因素。以往认为细胞生存所需氧浓度与大气中氧浓度(21%，160mmHg)相同，但在生物体内并非如此，氧气从被吸入肺部然后随血液运送至全身，到达器官和组织时其浓度和压力已非常低(2% ～9%，14～65 mmHg)。近年来研究亦显示，体内多种组织特别是含有干细胞的组织中氧浓度远远低于大气氧浓度，而微环境中的这种低氧状态不管对胚胎干细胞还是成体干细胞的生物学行为影响都非常巨大［1］。如骨髓间充质干细胞所处的微环境便是一种低氧环境，氧浓度约为1% ～7%。体外实验表明，低氧可以使干细胞的细胞周期减慢，分化减少。1%氧浓度下较21%氧浓度下，间充质干细胞发生了各方面的变化。细胞在形态上表现出体积增大;细胞的增殖明显减少并且大部分停止在G1期［2］。另有研究表明，低氧在骨髓造血干细胞和间充质干细胞的增殖和成熟过程中起重要作用。且低氧持续时间是细胞分化潜能的一个鉴定指标。在更接近于生理条件的缺氧环境中持续培养的研究显示，与常氧浓度下培养相比，在5%氧浓度下，细胞的分化减少，其干细胞特性保持的更强，这可能暗示体内的低氧环境可以使更多的干细胞处于静息状态［3］。对于神经母细胞瘤细胞，间歇性低氧可以增强其类似干细胞的特性，并抑制其分化倾向，这似乎从另一方面证明了氧浓度对干细胞的作用［4］。

神经干细胞是干细胞的一种，具有自我更新、增殖及分化成星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元的能力。在成体，神经干细胞主要存在于侧脑室室管膜下层(subventricular zone，SVZ)和海马齿状回颗粒下层(subgranular zone，SGZ)，这是目前公认的两个神经发生区域。有研究显示小鼠的脑组织中氧分压亦远低于大气，中脑处约为0.55%，大脑皮质处约为8%，神经干细胞亦处于一种相对低氧的特殊微环境中，推测该微环境中氧浓度约为2.5% ～3%［5］。生理状态下的这种低氧会减慢细胞周期和抑制分化，可能对神经干细胞保持一种未分化的类似“休眠”的稳定状态有一定作用［6］，体外研究也证实了这一点。在缺血缺氧性脑卒中事件中，神经干细胞所处的微环境更为特殊，其中的氧浓度较生理状态更低，但研究显示，在大脑中动脉闭塞引起局灶性脑缺血缺氧部位移植神经干/祖细胞，不但神经干细胞自身的存活能力及增殖分化能力提高，而且可以减少局部神经元的凋亡，这个过程主要由缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α)-血 管 内 皮 生 长 因 子 (Vascular endothelial growth factors，VEGF)信号途径(HIF-1α-VEGF)介导［7］。因此，氧浓度是神经干细胞生存微环境中重要的组成部分，低氧能够增强神经干细胞自身的增殖和成熟过程，同时神经干细胞通过一系列的变化也影响其所处的微环境。

2 低氧影响神经干细胞的增殖和分化

在体内环境中，从胚胎形成到围产期以及成人的神经发育过程中，神经干细胞所处的氧浓度是不断变化的。如前所述，神经干细胞在成体内多数情况下处于一种类似“休眠”的状态，但受到各种生理或病理性刺激时，神经干细胞就会进入增殖及分化阶段。而缺血性脑卒中是重要的刺激因素之一，Ohira等人发现，缺血性损伤会激活新大脑皮质的神经干细胞和神经祖细胞，并促进其增殖和分化［8］。在发生缺血性脑卒中的脑组织局部会形成特殊的血管微环境，而血管周围相对的缺血缺氧状态是影响神经干细胞生物学行为的主要因素。在缺血缺氧性脑卒中事件中，大脑会出现自身的修复，并且存在新的神经元的发生。最新研究表明，神经干细胞会向缺血缺氧的脑组织区域募集，趋化因子CCL2及其受体CCR2在此过程中起关键作用［9］。被募集到缺血缺氧的脑组织区域的神经干细胞的存活及增殖能力都大大提高，并且通过间质衍生因子-1和血管生成素-1与血管的重建和再生产生密切关联。

在体外培养条件下，氧浓度对神经干细胞增殖和分化的影响显得更为突出。早在2000年，Studer等人就提出了氧浓度对神经干细胞的生物学作用，他们通过对比常氧(152mmHg)和低氧(22.8±15.2mmHg)环境下鼠胚胎神经祖细胞的培养发现，低氧浓度促进细胞的增殖，同时减少了细胞的凋亡;另外，神经祖细胞向神经元的分化亦受影响，在低氧浓度下，多巴胺能神经元比率上升到56%，而常氧浓度下其比率仅为18%［10］。而最近研究显示，在低氧浓度下(2%O2)，胚胎干细胞在早期会出现一定程度的分化，且主要为神经祖细胞的分化。这个过程主要靠成纤维细胞生长因子4(fibroblast growth factor，FGF4)/细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)的自分泌和糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)信号通路调节［11］。因此，氧气在神经系统的发生及形成过程中均扮演着重要的角色。Morrison等也提出在低氧浓度下(38mmHg)神经嵴干细胞的存活率、增殖率及儿茶酚胺类神经元的分化率均提高［12］。另有研究表明，源于孕15～16d的美国癌症研究所小鼠(institute of cancer researcch，ICR)胚胎的神经干细胞在15.2mmHg的氧浓度下表现出最强的增殖及分化能力［13］。低氧和抗氧化剂也可增加来源于肠神经系统的神经干细胞的增殖。而来源于人类胚胎干细胞的神经干细胞，在3%氧浓度下与常氧浓度下相比其存活率亦增加，且在特定趋化因子作用下，可以向脊髓运动神经元、多巴胺神经元、运动神经元前体细胞特定分化［14］。因此，在体外培养条件下，氧浓度会促进神经干细胞的增殖，对其分化方向也有一定诱导作用，且主要向多巴胺能神经元分化。在体内及体外条件下，氧浓度对神经干细胞的调节主要涉及以下几个机制。

2.1 细胞因子及相关信号途径 HIF-1是氧浓度对神经干细胞增殖及分化调节过程中重要的细胞因子，有α和β两个亚基。HIF-1α是调节细胞缺氧适应过程中重要的转录激活因子，在多数细胞和组织中，其含量很低，在胞质内处于失活状态;但是在缺氧条件下其含量则升高，可被激活并转移到细胞核并与HIF-1β形成HIF-1分子，识别并结合包含有低氧反应元件的DNA序列。

在缺血性神经系统疾病中，HIF-1α在神经祖细胞的存活及替代缺血坏死神经细胞的过程中起重要作用。HIF-1α通过对细胞新陈代谢、血管再生的直接转录调节来完成机体对缺氧的适应［15］。在胚胎干细胞中HIF-1α主要是通过提高β-连环蛋白(β-catenin)的活性及下游效应器淋巴增强因子-1(lymphoid enhancer factor-1，LEF-1)和 T细胞因子 1(Tcellfactor4，TCF-4)的表达来调节Wnt/β-catenin信号通路。这种调节在神经干细胞中也是存在的，但是在已分化的细胞中未发现［16］。另有研究表明，在成年脑组织的神经发生区域、神经干/祖细胞、出生后的小鼠脑组织中，HIF-1α持续表达。在正常情况下的神经干/祖细胞中，HIF-1α不会发生典型的羟基化、泛素化及退化。HIF-1α主要存在于细胞质的膜结构中，免疫电子显微镜证实了含有HIF-1α的囊泡，这种结构可能防止HIF-1α的退化。而经过HIF-1α相关基因敲除的神经干/祖细胞对缺氧的耐受性降低，且Notch-1和β-catenin的表达水平发生显著的变化，而这些分子与缺氧耐受存在密切关系［17］。

Wnt/β-catenin信号通路是调控细胞增殖的关键通路，在低氧促进神经干细胞增殖过程中也起着重要作用。研究显示，在利用缺氧(5%O2)环境促进海马神经干细胞增殖过程中，Wnt/β-catenin信号途径起关键作用，β-catenin是其中主要的蛋白［18］。在体内，Wnt/β-catenin信号通路的活性与SGZ密切相关，而该处亦是神经干细胞发生的主要区域。HIF-1α缺失会使Wnt/β-catenin信号通路受抑制，从而使干细胞的增殖、分化及成熟受累［16］。

另外，缺氧促进神经祖细胞的增殖和分化，此过程中促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)促进了细胞的分化，减少了细胞的凋亡。缺氧特异性的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子过度表达有利于移植神经干细胞存活和神经功能的改善［19］。而EPO联合粒细胞集落刺激因子能够促进缺血缺氧动物模型神经功能的恢复，其机制包括增强抗细胞凋亡蛋白bcl-2的表达，增强神经营养因子的合成和促进新生血管再生［20］。也有研究显示，缺氧诱导的VEGF基因表达系统能够调节神经干细胞的存活力。表达缺氧特异性VEGF的神经干细胞应用于脊髓损伤模型中，可以提高移植细胞的存活率及促进血管再生，同时抑制不需要的细胞及血管的增生［21］。

2.2 基因水平改变 基因水平改变其实是细胞因子及相关信号通路调节过程中的一个关键环节，它们相互促进，不可分割。当然这个过程中也会存在一些特殊的变化。研究表明，非编码微小 RNA(non coding RNA，ncRNA)在神经发育、细胞存活等过程中扮演关键角色。在缺氧条件下，ncRNAs参与细胞增殖的调节过程，有15种微小RNA(microRNA，miR)的水平上调，11种下调，其中miR-210上调明显。进一步研究表明 HIF-1α对miR-210有直接影响作用［22］。在基因修复方面，核酸内切酶Neil3可以通过准确的DNA分子修复使神经干细胞避免遭受缺血缺氧损伤，而Neil 3缺陷的神经干细胞不能完成向神经祖细胞的增殖和单链DNA氧化应激的修复［23］。另外，反转录酶-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)分析显示表达细胞间黏附分子的mRNA水平亦发生改变，其中最明显的是表达基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的mRNA。在1%氧浓度下，抑制MMP-9的活性，细胞的增殖和迁移会降低，而且，通过Wnt通路拮抗剂DKK-1(dikkopf-1)抑制HIF-1α介导的经典Wnt信号通路时，细胞的增殖降低，MMP-9表达也减少。因此，MMP-9亦是低氧浓度促进干细胞增殖机制中的关键分子之一［24］。

2.3 代谢水平的变化 能量代谢中的相关分子和信号途径影响神经干细胞的功能，包括胰岛素生长因子(insulin growth factor 1，IGF-1)-转录因子FoxO和IGF-1-雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号途径、腺苷酸活化蛋白激酶、沉默信息调节因子(silentmating type information regulation 2 homolog1，SIRT1)和HIF。在低氧(3%O2)条件下，培养基中葡萄糖含量降低，而丙酮酸、乳酸含量升高，说明在低氧环境下，神经祖细胞主要靠糖酵解获取能量。而这一过程中，通过对基因分析检测发现，1.24%的基因表达发生变化，其中绝大多数涉及糖酵解途径［25］。另外，在体外缺氧诱导神经干细胞的增殖过程中，代谢型谷氨酸受体亚型5(metabotropic glutamate receptor 5 subtype，mGluR5) 的表达有增高。在此过程中胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)和氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)信号通路及细胞周期蛋白 D1的表达增加。这些结果还表明mGluR5参与神经干细胞增殖，并且为中枢神经系统缺血/缺氧损伤后的神经功能修复提供了一个目标分子［26］。

3 缺氧预处理提高神经干细胞对抗缺血缺氧的能力

低氧预适应是机体的一种重要的内源性保护机制，而缺氧预处理对于神经干细胞是否亦存在同样的保护作用呢?如前所述，人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)移植是治疗缺血性卒中颇具潜力的治疗方法，但是宿主的内环境阻碍了此技术的发展。最近研究表明经缺氧预处理的ESCs适应能力增强。将来源于hESCs的神经球在0.1%氧浓度下培养12h，然后在21%氧继续培养分化，免疫组织化学及电生理检查证明预处理能增强细胞分化。且这种神经保护作用至少持续5d，具有神经保护作用的蛋白质的表达也相应上调［27］。缺氧预处理增强干细胞对抗缺血缺氧能力的同时，对于移植细胞和宿主细胞的存活率都能提高。缺氧预处理的脂肪来源的间充质干细胞与未经缺氧预处理的相比，形态学没有发生明显的变化，且这种经缺氧预处理干细胞与神经干细胞共同移植时，能够提高神经干细胞的存活率，减少凋亡因子Bax的表达［28］。缺氧预处理增强神经干细胞对抗缺血缺氧能力的机制尚不十分明确，研究表明，缺氧预处理后免疫印迹显示HIF-1α和HIF-2α的表达增强，同时引起了一系列相互促进的反应，包括EPO、VEGF和 Bcl 2家族成员［27］。另有研究表明，在鼠神经干细胞的缺氧预适应中涉及到Xc系统(胱氨酸和谷氨酸跨膜转运的跨膜蛋白)，并证明该蛋白与缺氧预适应的神经保护作用有关［29］。缝隙连接在缺氧预处理过程中亦发生变化，缝隙连接是宿主细胞和被移植的神经干细胞之间重要的结构，它对细胞的功能及细胞之间的相互作用非常重要。在中枢神经系统缺血缺氧性疾病中，缝隙连接会增多。此研究显示，缺氧预处理，会使连接蛋白43(connexin 43，Cx43)的表达增高，宿主和移植物之间的信息流通提高。本研究显示，对神经干细胞进行3h的缺氧预处理，会使Cx43的表达提高31%［30］。

4 展望

氧浓度对神经干细胞增殖和分化的研究使得干细胞学科更加完善和深入，并且必将推动神经干细胞移植治疗的进一步发展，尤其是在缺血缺氧性脑卒中中的应用与研究。虽然低氧条件下的神经干细胞培养实验已取得一定进展，但仍存在很多的未知，这需要我们进一步的研究。

［1］Eliasson P，Jonsson JI.The hematopoietic stem cell niche:low in oxygen but a nice place to be［J］.Cell Physiol，2010，222:17-22.

［2］Holzwarth C，Vaegler M，Gieseke F，etal.Low physiologic oxygen tensions reduce proliferation and differentiation of human multipotent mesenchymal stromal cells［J］.BMC Cell Biol，2010，11:11.

［3］Basciano L，Nemos C，Foliguet B，etal.Long term culture ofmesenchymal stem cells in hypoxia promotes a genetic program maintaining their undifferentiated and multipotent status［J］.BMC Cell Biol，2011，12:12.

［4］Bhaskara VK，Mohanam I，Rao JS，etal.Intermittenthypoxia regulates stem-like characteristics and differentiation of neuroblastoma cells［J］.PLoSOne，2012，7(2):e30905.

［5］Santilli G，Lamorte G，Carlessi L，etal.Mild hypoxia enhances proliferation and multipotency of human neural stem cells［J］.PloS one，2010，5:e8575.

［6］Koning M，Werker PM，van Luyn MJ，etal.Hypoxia promotes proliferation of humanmyogenic satellite cells:a potential benefactor in tissue engineering of skeletalmuscle［J］.Tissue Eng Part A，2011，17(13 ～14):1747-1758.

［7］Harms KM，Li L，Cunningham LA.Murine neural stem/progenitor cells protectneurons against ischemia by HIF-1alpha-regulated VEGF signaling［J］.PLoSONE，2010，5(3):e9767.

［8］Ohira K，Furuta T，Hioki H，etal.Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells［J］.Nat Neurosci，2010，13，173-179.

［9］Andres RH，Choi R，Pendharkar AV，etal.The CCR2/CCL2 interaction mediates the transendothelial recruitment of intravascularly delivered neural stem cells to the ischemic brain［J］.Stroke，2011，42(10):2923-2931.

［10］Studer L，Csete M，SangHun L，etal.Enhanced proliferation，survival，and dopaminergic differentiation of CNSprecursors in lowered oxygen［J］.Neurosci，2000，20:7377-7383.

［11］Fernandes TG，Diogo MM，Fernandes-Platzgummer A，etal.Different stages of pluripotency determine distinct patterns of proliferation，metabolism，and lineage commitment of embryonic stem cells under hypoxia［J］.Stem Cell Res，2010，5(1):76-89.

［12］Morrison SJ，Csete M，Groves A，etal.Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells［J］.Neurosci，2000，19:7370-7376.

［13］Horie N，So K，Moriya T，etal.Effects of oxygen concentration on the proliferation and differentiation of mouse neural stem cells in vitro［J］.Cell Mol Neurobiol，2008，28:833-845.

［14］Stacpoole SR，Bilican B，Webber DJ，etal.Efficient derivation of NPCs，spinalmotor neurons and midbrain dopaminergic neurons from hESCs at3%oxygen［J］.Nat Protoc，2011，6(8):1229-1240.

［15］Cunningham LA，Candelario K，Li L.Roles for HIF-1α in neural stem cell function and the regenerative response to stroke［J］.Behav Brain Res，2012，227(2):410-417.

［16］Mazumdar J，O＇Brien WT，Johnson RS，etal.O2regulates stem cells through Wnt/β-catenin signalling［J］.Nat Cell Biol，2010，12(10):1007-1013.

［17］Roitbak T，Surviladze Z，Cunningham LA.Continuous expression of HIF-1α in neural stem/progenitor cells［J］.Cell Mol Neurobiol，2011，31(1):119-133.

［18］Cui XP，Xing Y，Chen JM，etal.Wnt/beta-catenin is involved in the proliferation of hippocampal neural stem cells induced by hypoxia［J］.Ir JMed Sci，2011，180(2):387-393.

［19］Kim HJ，Oh JS，An SS，etal.Hypoxia-specific GM-CSF-overexpressing neural stem cells improve graft survivaland functional recovery in spinal cord injury［J］.Gene Ther，2011，10:1038.

［20］Liu SP，Lee SD，Lee HT，etal.Granulocyte colony-stimulating factor activating HIF-1alpha acts synergistically with erythropoietin to promote tissue plasticity［J］.PLoSOne，2010，5(4):e10093.

［21］Oh JS，An SS，Gwak SJ，etal.Hypoxia-specific VEGF-expressing neural stem cells in spinal cord injury model［J］.Neuroreport，2012，23(3):174-178.

［22］Liu ZH，Yang G，Zhao T，etal.Small ncRNA expression and regulation under hypoxia in neural progenitor cells［J］.Cell Mol Neurobiol，2011，31(1):1-5.

［23］Sejersted Y，Hildrestrand GA，Kunke D，etal.Endonuclease VIII-like 3(Neil3)DNA glycosylase promotes neurogenesis induced by hypoxia-ischemia［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(46):18802-18807.

［24］Ingraham CA，Park GC，Makarenkova HP，etal.Matrixmetalloproteinase(MMP)-9 induced by Wnt signaling increases the proliferation and migration of embryonic neural stem cells at low O2levels［J］.Biol Chem，2011，286(20):17649-17657.

［25］Zhu LL，Zhao T，Huang X，etal.Gene expression profiles and metabolic changes in embryonic neural progenitor cells under low oxygen［J］.Cell Reprogram，2011，13(2):113-120.

［26］Watmuff B，Pouton CW，Haynes JM.In vitromaturation of dopaminergic neurons derived from mouse embryonic stem cells:implications for transplantation［J］.PLoSOne，2012，7(2):e31999.

［27］Francis KR，Wei L.Human embryonic stem cell neural differentiation and enhanced cell survival promoted by hypoxic preconditioning［J］.Cell Death Dis，2010，1:e22.

［28］Oh Js，Ha Y，An SS，etal.Hypoxia-preconditioned adipose tissue-derived mesenchymal stem cell increase the survival and gene expression of engineered neural stem cells in a spinal cord injury model［J］.Neurosci Lett，2010，472(3):215-219.

［29］Sims B，Clarke M，Francillion L，etal.Hypoxic preconditioning involves system Xc-regulation in mouse neural stem cells［J］.Stem Cell Res，2012，8(2):285-291.

［30］Juderstad J，Brismar H，Herlenius E.Hypoxic preconditioning increases gap-junctional graft and host communication［J］.Neuroreport，2010，21(17):1126-1132.