重组人食管癌相关基因4蛋白的体外抑癌功能研究

李晓燕 高天慧 周云 王文玉 李林蔚

食管癌是一种严重危害我们人类健康的起源于消化道食管黏膜上皮的恶性肿瘤，而且食管癌的发病率和死亡率在世界上均排名恶性肿瘤的前列［1，2］。更为重要的是，中国历年来是食管癌的高发地区，其中最主要的病理类型为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)［3，4］。

人食管癌相关基因4(esophageal cancer related gene 4，ECRG4)是重要的食管癌相关的新基因［5，6］。我们发现，人食管癌相关基因4的基因表达的下降在食管鳞状细胞癌的发生中具有非常重要的地位。目前，人食管癌相关基因4蛋白的生物学抑制肿瘤生长的功能还不清楚。我们的初期研究结果表明，人食管癌相关基因4是食管癌的候选抑癌基因，人食管癌相关基因4蛋白是食管癌预后的标志物。人食管癌相关基因4可以通过参与炎症反应的中心通路，并且下调炎症产物环氧化酶-2的表达来发挥其抑制肿瘤细胞生长的功能［7-9］。Mori等［10］研究进一步证实了我们的结论。

以往的研究表明，人食管癌相关基因4是肿瘤相关抑癌基因，人食管癌相关基因4的表达过量能够抑制肿瘤细胞的生长增殖［7］。然而，关于人食管癌相关基因4蛋白的亚细胞定位和抗肿瘤增殖功能国内还未见报道。本实验中，我们检测人食管癌相关基因4蛋白的亚细胞定位，同时进一步研究纯化的重组人食管癌相关基因4蛋白的体外抑癌功能，研究重组人食管癌相关基因4蛋白能否成为未来的食管癌的生物治疗药物。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂 我们采用人的食管癌细胞系EC9706和NEC，和动物的永生化细胞株HEK293。实验细胞细胞培养利用含有10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI1640培养基，培养条件为37℃和5%CO2的饱和湿度培养箱。实验用的DMEM培养液、胎牛血清、青霉素和链霉素等试剂都购买于美国Gibco公司。医学科学院肿瘤研究所自己研制了抗人食管癌相关基因4蛋白的多克隆抗体［7］。羊抗兔 IgG购自 Santa Cruz公司。Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。

1.2 人食管癌相关基因4蛋白的亚细胞定位 1)内源性:将EC9706肿瘤细胞接种到准备好的培养皿中，等到肿瘤细胞生长到符合条件，采用即时准备的4%多聚甲醛固定肿瘤细胞10 min。PBS溶液冲洗三次。0.2%triton X-100细胞通透化处理10 min。PBS溶液冲洗三次。再利用即时准备的2%BSA封闭30 min。PBS溶液冲洗三次。然后我们再加入即时稀释的抗人食管癌相关基因4蛋白的多克隆抗体，在温箱中放置1 h。PBS洗三遍，5 min/次。加入荧光标记的二抗，室温孵育45 min。PBS溶液冲洗三次。然后我们再加入即时准备的0.5 μg/ml的DAPI溶液染色15 min。PBS溶液冲洗三次。最后我们加入即时准备的20 μl封片剂封片，冰箱中备用。荧光照相装置利用激光共聚焦显微镜拍照定位。DAPI(蓝色)染细胞核。2)外源性:我们利用NEC肿瘤细胞转染标记了绿色荧光蛋白的人食管癌相关基因4的基因质粒，表达出了伴随有绿色荧光蛋白的人食管癌相关基因4蛋白。具体步骤为将EC9706肿瘤细胞接种到准备好的培养皿中，等到肿瘤细胞生长到符合条件，参照LipofectminTM2000试剂盒的说明分别转染pEGFP-N1-ECRG4及空载质粒。2 d后扔掉肿瘤细胞培养基，PBS溶液冲洗三次，取出玻片，然后用4%的多聚甲醛固定肿瘤细胞30 min。PBS溶液冲洗三次，然后在玻片上加入一定的甘油缓冲液(将NaHCO33.7 g和Na2CO30.6 g溶于100 ml去离子水中，用NaOH调pH至9.5，加入等量的甘油，充分混合)，盖在载玻片上，封片，防止气泡产生。荧光照相装置利用激光共聚焦显微镜拍照定位。

1.3 分泌蛋白的检测 计数瞬转后培养24 h的EC9706/pcDNA3.1和EC9706/pcDNA3.1-ECRG4细胞，然后我们扔掉肿瘤细胞培养基，然后肿瘤细胞离心15 min，然后我们用滤膜过滤肿瘤细胞培养液，滤过液Heto FD3(Heto-Holten，Denmark)浓缩。

1.4 MTT肿瘤细胞抑制实验 将一定数量的EC9706肿瘤细胞接种到细胞培养板中，然后利用PBS溶液冲洗肿瘤细胞培养孔三次，然后我们用相应的浓度的重组人食管癌相关基因4蛋白溶液处理肿瘤细胞，并设立对照实验组，肿瘤细胞再继续培养48 h，检测时我们每孔加入即时配制的MTT溶液15 μl，然后肿瘤细胞再培养4 h，最后我们扔掉肿瘤细胞培养液，每孔中再加入DMSO溶液150 μl，混匀溶液，最后我们利用酶标仪测定溶液吸光度值。

1.5 统计学方法 使用SPSS 11.0软件进行实验的统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人食管癌相关基因4蛋白的定位 1)内源性:利用免疫荧光染色的方法证实内源性表达的人食管癌相关基因4蛋白的定位是位于细胞中的细胞质部位。2)外源性:利用绿色荧光蛋白标记人食管癌相关基因4蛋白的方法证实，外源性表达的人食管癌相关基因4蛋白的定位也位于细胞中的细胞质部位。

2.2 人食管癌相关基因4蛋白是分泌性蛋白 利用Western blot的检测方法证实，人食管癌相关基因4蛋白是分泌性蛋白。

2.3 重组人食管癌相关基因4蛋白体外抑制肿瘤细胞增殖

利用MTT检测的方法证实，重组人食管癌相关基因4蛋白能够在细胞培养液中抑制肿瘤细胞的生长增殖(P＜0.05)。

3 讨论

人食管癌相关基因4是与食管癌发生发展相关的重要的新基因，因此研究人食管癌相关基因4蛋白的生物学功能将具有重要的意义。研究结果表明内源性和外源性人食管癌相关基因4蛋白都定位于细胞质。而生物信息学分析提示，组成人食管癌相关基因4蛋白的148个氨基酸中，1-31个氨基酸为信号肽，是重要的分泌性蛋白质。本研究中，我们利用Western blot的检测方法证实，人食管癌相关基因4蛋白的确是分泌性蛋白质。而且，研究中我们进一步通过优化条件表达和纯化出大量可溶性的重组人食管癌相关基因4蛋白。实验结果表明，我们表达和纯化的水溶性的重组人食管癌相关基因4蛋白具有体外抑制肿瘤细胞增殖的生物学功能活性，为进一步研究人食管癌相关基因4蛋白的晶体结构和独特的抗肿瘤生物学功能创造了有利条件。

更重要的是，纯化的水溶性重组人食管癌相关基因4蛋白可以作为食管癌的潜在治疗药物，值得进一步深入的进行体内抗癌作用和抗癌作用机理研究。我们的结果首次证明了人食管癌相关基因4蛋白是分泌蛋白。目前，我们正在进一步深入的研究人食管癌相关基因4蛋白的体内外抑癌功能和作用机理，阐明其在食管癌发生中的作用。

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