微卫星不稳定性在恶性肿瘤研究中的进展

陈春林(综述)， 邓 飞(审校)， 于燕妮

(遵义医学院附属医院 病理科， 贵州 遵义 563000)

·综述·

微卫星不稳定性在恶性肿瘤研究中的进展

陈春林(综述)， 邓 飞(审校)， 于燕妮

(遵义医学院附属医院 病理科， 贵州 遵义 563000)

微卫星；微卫星不稳定性；错配修复基因；恶性肿瘤

微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)现在已经被公认为是恶性肿瘤形成的一个新机制，人们越来越关注MSI在恶性肿瘤中的临床应用价值。自1993年[1]在遗传性非息肉样结直肠癌(hereditary non-polyposis colorectal cancer, HNPCC)中发现有较高比例的MSI以来，在许多肿瘤如肺癌、肝癌、食管癌、淋巴瘤、头颈部肿瘤、泌尿系肿瘤、生殖系统肿瘤、儿童胚胎性肿瘤中都报道了存在MSI。MSI已经成为近年来分子生物学研究的热点之一，对MSI的产生机制及其在肿瘤发生发展、早期诊断、个体化治疗、监测预后及复发等方面的研究已经取得了较大的进展。

1 微卫星不稳定性的简介

在20世纪70年代，研究者就已经发现真核生物基因组中存在微卫星(microsatellite，MS ) DNA，直到80年代初期,人们对微卫星DNA才有了深入的了解。它们广泛分布在原核和真核生物的基因组中，是短的串联重复序列, 大约占人类基因组的10%。微卫星由2～6个核苷酸组成，其中以二核苷酸重复序列即(CA/GT)n最为常见，n为重复次数，通常为15～60次。微卫星DNA 具有高度多态性及遗传稳定性，即不同个体重复序列的重复次数不同，而同一个体的正常体细胞在生长发育过程中其重复序列的重复次数是保持不变的，其自发突变率为10-1～10-5。微卫星已经成为法医个体鉴定、遗传学图谱制作、移植相容性检测等的重要特殊指标。

MSI是指由于基因复制错误引起基因组中重复序列次数的增加或丢失，导致微卫星片段长度发生了缩短或延长。在基因组正常复制的情况下，如果DNA碱基发生错配，错配修复(mismatch repair， MMR)基因会对其进行修复，保持其遗传信息的正确性；但是如果MMR基因发生突变，则会导致MMR功能缺陷，不能修复错配碱基，从而使DNA产生遗传不稳定性，最终导致肿瘤易感。目前，已经发现6个MMR基因即hMSH2、hMSH3 、hMSH6 、hMLHl、hPMSl和hPSM2[2]。MLH1、 MSH2、 MSH6及 PMS2四个MMR基因中的任何一个发生杂合性突变，都会引起HNPCC[3]。其中hMSH2、hMLHl在MSI的HNPCC及散发性结直肠癌中突变率较高，这些基因突变可发生在编码区或调控区，DNA修复基因、细胞生长抑制基因及凋亡基因都是其靶基因[4]。在子宫内膜癌、卵巢癌也发现有hMSH2和hMLH1的突变，在子宫内膜癌中还发现有hMSH3的突变。Ripperger等[5]报道了两例由于MSH6突变导致MMR缺陷，进而产生T细胞淋巴瘤和结肠腺癌的案例，并认为对于儿童白血病/淋巴瘤患者而言，MMR基因的等位基因突变会引起一系列的MMR缺陷。在研究肿瘤发生时，发现在MSI肿瘤里频繁的发生MMR缺陷，MSI检测已经成为筛选错配基因突变肿瘤的一个重要方法。了解肿瘤及癌前病变的MSI及其MMR 基因缺陷，以及细胞恶变的病理过程，有利于对肿瘤细胞遗传生化的研究并了解肿瘤发生的新机制，同时，也有助于发现新的抑癌基因或疾病易感基因。

2 如何检测肿瘤组织中的微卫星不稳定性

大量研究表明MSI仅在肿瘤细胞中表达，与肿瘤相邻的正常组织中从未发现MSI，说明MS可能是一种检测肿瘤的特异性分子标记。目前MSI在肿瘤及遗传病诊断方面的检测显示了广阔的前景，MSI的应用可以推动肿瘤预防、早期诊断、早期治疗及个体化治疗，提高肿瘤病人的生活质量和生存率，监测治疗后的复发。检测MSI的方法步骤主要包括：①收集肿瘤组织及自身正常对照组织标本；②采用传统蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提基因组DNA或者是改良的试剂盒抽提基因组DNA；③设计并合成特异性引物，进行PCR扩增；④扩增产物变性后行聚丙烯酰胺凝胶分离电泳，硝酸银染色，分析结果。

美国国立癌症研究所在1996年的会议上对HNPCC及散发性结直肠癌MSI判定拟定了推荐标准[6]，选取5个MS位点即BAT一25、BAT一26、D5S346、D2S125、Dl7S240，当其中有≥2个MS位点出现不稳定时，定义为高频率MSI(highfrequent MSI，MSI-H)；有1个MS位点不稳定时，定义为低频率MSI(1ow frequent MSI，MSI—L)；无MS位点不稳定时，定义为微卫星稳定(micmsatellite stability，MSS)。在之后的研究报道中，其他肿瘤在判定MSI时多数也采用了这一推荐标准。若检测的微卫星数目增加，当其中有≥40%的MS位点出现不稳定时，定义为MSI-H。

3 微卫星不稳定性在肿瘤临床应用中的价值

3.1 微卫星不稳定性与膀胱癌 染色体MS改变可能是膀胱移行细胞癌(bladder transitional cell carcinoma,BTCC)发生过程中多基因突变的一种表现形式。尿沉渣MSI检测敏感性远高于尿细胞学检查,将MSDNA作为分子标记应用于膀胱癌早期诊断及肿瘤治疗后监测复发具有临床实用价值。1994年Mao等[7]第一次报道了在同一患者相应的痰和尿标本中都发现了与原发膀胱肿瘤完全相同的MSI改变，并且敏感性很高，可以将1个肿瘤脱落细胞从200～1000个正常细胞中筛选出来。因此他们认为适当的MS位点能够作为检测膀胱肿瘤细胞的分子标记。Steiner等[8]检测了11例膀胱复发肿瘤患者的尿沉渣，结果10例(90.9%)尿沉渣表现出MSI，说明适当的微卫星位点分析对膀胱癌的复发监测有重要意义。吕英谦等[9]利用PCR方法检测了35例膀胱癌患者术前尿沉渣中13个微卫星位点，经微卫星分析，31例(88.6%)可检出膀胱癌。12例复发肿瘤中10例可见微卫星改变(83%)，3例首先发现尿沉渣微卫星改变，经1～6个月继续随访后，经膀胱镜证实发现膀胱肿瘤。由此可见，检测染色体MS改变是BTCC早期诊断、监测复发的有效手段。

3.2 微卫星不稳定性与结直肠癌 检测肿瘤组织的MSI，在一定程度上可以反映出MMR基因的状态，并且可能检测出新的MMR基因，同时MSI的检测比MMR基因检测更经济、更简便。因此，MSI已被广泛应用作为散发性结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的诊断指标之一，特别针对家族史不完善或不符合HNPCC临床诊断指标的患者。Yoon等[10]使用免疫组化和MSI分析的方法评估CRC的MMR情况，免疫组化方法检测出207(10.2%)个肿瘤样本有MLH1或MSH2表达缺失，MSI分析有203(10%)个肿瘤样本为MSI-H。MSI-H结肠癌与MSS结肠癌相比较, 具有独特的临床病理学特征和分子生物学特征，原发病灶多位于右结肠、肿瘤细胞分化程度低、浸润组织更深、较少淋巴结转移、有较多炎症细胞浸润、多数伴有腺瘤、且预后较好，在Ⅱ、Ⅲ期结肠癌中，MSI-H型的患者5年生存率高于MSS型的患者[11]。绝大多数MSI-H 类的CRC涉及hMLHl 和hMSH2基因结构和功能的改变, 一般表现为丧失表达功能蛋白的能力，少数表现为hMLHl基因突变或启动子CpG岛甲基化，现认为在CRC和胃癌中，MSI的发生除了生殖细胞MMR基因的突变途径以外， 还与hMLHl 启动子异常甲基化有关[12]，启动子甲基化通常表现为基因杂合性丢失、基因表达能力下降或缺失、蛋白产物活性下降或丧失。孟文建等[13]认为人T细胞因子4(hTCF-4)外显子3～9突变与MSI-H散发性直肠癌患者高度相关。Herkert等[14]对4例儿童肠癌和息肉病做回顾性研究，发现所有病人的肿瘤显示MSI和(或) PMS2表达缺失。MSI+的直肠癌被分为CpG岛甲基化阳性(CIMP+)和CpG岛甲基化阴性(CIMP-)两种类型， MSI+直肠癌的临床病理特征取决于CIMP状态[15]，CIMP+和CIMP-表现出不同的临床病理特征，这可能为特异性治疗MSI+的直肠癌提供线索。

3.3 微卫星不稳定性与女性肿瘤 乳腺癌(breast cancer, BC)是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病的分子机制仍不十分明确，严重威胁着女性的身体健康。为了寻找更有效的诊断及判断预后的分子标志,为BC的发生及预后判断提供理论依据，研究者正在探索乳腺癌的微卫星不稳定性及其与乳腺癌临床病理的关系。吕丽琼等[16]发现乳腺癌中普遍存在MSI，且MSI常常发生在HER2表达、有腋窝淋巴结转移及临床分期晚期的患者中,预后较差的乳腺癌患者中MSI的发生率更高,MSI可以作为判断乳腺癌临床分期及预后评估的一个分子标志。线粒体DNA(mtDNA)的突变率约为核DNA的10倍，突变形式包括缺失、插入、微卫星不稳定等，偶然的突变即可导致DNA序列发生改变，使得编码蛋白也随之改变，进而可能导致细胞癌变。mtDNA微卫星不稳定现已成为研究的热点之一。Park等[17]发现mtDNA微卫星不稳定在癌症发展的早期阶段发挥了重要作用，可能是促进了肿瘤细胞中活性氧生成及细胞凋亡过程。在国际妇产科学联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)分期为1期的子宫内膜腺癌中，MSI发生率高、p21表达低及生物素表达高是其预后不良的指标[18]。

3.4 微卫星不稳定性与肺癌 微卫星DNA不稳定性普遍存在于各种病理类型肺癌中, 是其发病机理中共有的机制，并且在不同的肺癌发展阶段均可发现微卫星DNA改变，在肺癌发生的早期及肺癌的发展、转移过程中发挥一定的作用。李军等[19]检测肺癌支气管冲洗加肺泡灌洗液中微卫星DNA不稳定性，发现其阳性率高,特异性好,在病变早期即可发现。在周围型肺癌中，联合检测支气管冲洗加肺泡灌洗液中微卫星DNA改变与脱落细胞学，发现两者具有互补性，比传统的纤支镜活检或刷检敏感性高。因此这对肺癌的诊断更具有实用价值。李曼等[20]通过对肺癌进行微卫星不稳定性(MSI)分析，以及对错配修复基因hMLH1、hMSH2蛋白表达进行检测，认为肺癌的发生可能存在MSI途径，而hMLH1与hMSH2的表达失活导致了MSI的发生，因此，MSI可作为肺癌诊断的指标之一。戴纪刚等[21]发现肺癌组织线粒体DNA的拷贝数/细胞显著低于相对应的正常肺组织，推测可能与控制区内的微卫星不稳定性有关。廖秀清等[22]发现在癌前病变组织中的MSI发生率显著高于肺癌组织和正常肺组织，肺癌组织中MSI及p16甲基化的发生率显著高于正常肺组织，因此认为联合检测MSI和p16基因启动子甲基化可以显著提高早期肺癌的诊断敏感性同时不降低其特异性，值得临床广泛推广。

3.5 微卫星不稳定性与非霍奇金淋巴瘤 在NHL中检测到大量的共同细胞遗传学缺失区域(regions of common cytogeneticdeletion, RCD)，显示抑癌基因功能的丢失与NHL的病理及临床表现有着密切联系，在这些RCD中检测杂合性丢失(LOH)，证实存在最小分子学缺失区域(regions of minimal molecular deletion, RMD)，主要是位于第6、7、13号染色体上。Takeuchi等[23]发现原发性儿童急性淋巴母细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)的6号染色体上的两个MSI热点：6q21-22和6q21。赵静等[24]检测T-NHL中6号染色体长臂(6q)上多个MS位点的改变情况，发现6qLOH与T-NHL的恶性程度有相关性，6q21-22和6q25区段可能存在抑癌基因，并且它们的失活可能在T-NHL发病机制中有十分重要的作用。罗春英等[25]在探讨MSI及MMR功能缺陷在非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkins lymphoma，NHL)发病机制中的意义时，发现T细胞和B细胞NHL中都存在MSI和MMR蛋白表达缺陷， 其中MSI和MMR功能缺陷在B细胞NHL发病机制中的作用小，Gamberi等[26]也得出同样的结论，他们对B细胞NHL进行微卫星不稳定性分析，定义2个或2个以上位点突变为MSI，结果没有发现一例MSI阳性。Lee等[27]对22例胃B细胞淋巴瘤样本中的七个微卫星位点进行研究，定义低于40%被检MS位点阳性为MSI-L，高于40%被检位点阳性为MSI-H，结果发现MSI-L阳性率为40.9%(9/22)，未发现有MSI-H。大量文献显示MSI和MMR功能缺陷在T细胞NHL发病机制中起到十分重要的作用。对于儿童白血病/淋巴瘤患者而言, MMR功能缺陷主要与T细胞淋巴瘤有关。最近，在一些分散的与慢性免疫抑制有关的肿瘤中也发现了MSI现象。Borie等[28]研究了免疫缺陷相关的NHL(immunodeficiency-related non-Hodgkin lymphomas,ID-RL)的生物学、治疗及临床特征，发现ID-RL 中MMR缺陷的机制不同于其他散在的MSI肿瘤。

综合国内外文献，MSI与NHL之间存在一定的相关性，但是其相关程度没有统一的认识，原因可能与选取的样本量大小、不同的微卫星位点、肿瘤的类型和临床特征等的差异有关。

4 展望

已经有很多肿瘤被证明与MSI有关，如原发性食管癌和原发性头颈部肿瘤、喉鳞癌、肺癌、女性生殖系统肿瘤、男性泌尿系统肿瘤、儿童胚胎性肿瘤等。在MSI-H肿瘤中，对MSI发生发展机制的研究已经取得了较大进展。大量研究发现[29]，MSI在肺癌、食管癌、膀胱癌早期诊断方面具有很高的特异性，并且伴有MSI的结直肠癌及食管癌病人预后好于不伴有MSI的病人，其原因有可能是：在各种致瘤因子刺激下产生MSI，从而调动整个机体产生相应的保护及抵抗机制，继而有较好的预后。在MSI胃癌、直结肠癌、子宫内膜癌中，易发生HDAC2基因移码突变及单核苷酸重复序列改变，HDACs有希望成为癌症治疗的目标靶点[30]。

MSI作为恶性肿瘤常见的遗传现象之一，作为MMR 基因突变的表型之一，作为基因突变和重排的来源之一，在肿瘤病变演进过程中起着重要的调控作用。应用PCR-SSCP 方法，可以直接检测出MSI 在细胞中的情况，间接反映出MMR 系统的异常。通过查找已经发生MSI的MS位点，找到新的与肿瘤相关的抑癌基因，并了解其基因产物的作用途径及方式，从而为新药的研制提供了新的目标靶点；同时也为临床筛查易感人群提供了新方法，有助于恶性肿瘤的预防、诊断、个性化治疗及预后监测，提高病人的生存率及生活质量。

[1] Asltonen LA, Pelkomski P, Leach FS, et al. Clues to the pathogenes of familial colorectal cancer[J]. Science, 1993,260:812-816.

[2]何立智.微卫星不稳定性与肿瘤的关系[J].实用癌症杂志,2000,11,15(6):670-672.

[3]Wimmer K,Etzler J.Constitutional mismatch repair-deficiency syndrome: have we so far seen only the tip of an iceberg[J].Hum Genet,2008,124(2):105-122.

[4]Viana-Pereira M, Lee A, Popov S, et al. Microsatellite Instability in Pediatric High Grade Glioma Is Associated with Genomic Profile and Differential Target[J]. Gene Inactivation, 2011, DOI: 10.1371.

[5]Ripperger T, Beger C, Rahner N, et al. Constitutional mismatch repair deficiency and childhood leukemia/lymphoma - report on a novel biallelic MSH6 mutation[J]. Haematol, 2010, 95(5): 841-844.

[6]Suraweera N, Duval A, Reperant M, et al. Evaluation of tumor microsalellite instability using five quasimonomorphic mononucleotide cepeals and pentaplex PCR[J].Gastroenlerology,2002,123:1804-1811.

[7]Mao L,Lee DJ,Tockman MS, et al. Microsatellite alterations as clonal markers for the detection of human cancer [J].Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:9871.

[8]Steiner G, Schoenberg MP, Lim JF, et al. Detection of bladder cancer recurrence by Microsatellite anllysis of urine[J].Nat Med, 1997, 3:621-624.

[9]吕英谦,唐东起,俞莉章.膀胱癌患者尿沉渣中微卫星不稳定性的临床意义[J].中华外科杂志,2000,38(4):294-296.

[10]Yoon YS,Yu CS,Kim TW,et al. Mismatch repair status in sporadic colorectal cancer: immunohistochemistry andmicrosatellite instability analyses[J].Gastroenterology and Hepatology,2011,26(12):1733-1739.

[11]郭光瑛.微卫星不稳定与结直肠癌关系[J].中国实用医药,2010,5(1):245-247.

[12]潘菲,来茂德.应用荧光标记多重PCR对散发性结直肠癌进行微卫星不稳定性检测[J].临床与实验病理学,2008,10:428-430.

[13]孟文建,王玲.人T细胞因子4外显子3～9突变在微卫星不稳定性直肠癌中的意义[J].中华实验外科杂志, 2010, 8: 1024-1026.

[14]Herkert JC, Niessen RC, Maria JW, et al. Paediatric intestinal cancer and polyposis due to bi-allelic PMS2 mutations: Case series, review and follow-up guidelines[J]. European Journal of Cancer, 2011,47(7):965-982.

[15] Bae JM,Kim JH,Kim JM,et al. Differential clinicopathological features in microsatellite instability-positive colorectal cancers depending on CIMP status[J].Virchows Arch,2011,459:55-63.

[16]吕丽琼,刘建勇.乳腺癌微卫星不稳定性及其与临床病理关系的研究[J].广西医科大学学报,2010,4:548-552.

[17]Park JS, Sharma LK, et al. A heteroplasmic, not homoplasmic, mitochondrial DNA mutation promotes tumorigenesis via alteration in reactive oxygen species generation and apoptosis Hum[J].Mol Genet,2009,18(9):1578-1589.

[18]Steinbak A, Malpica A, Slewa1A, et al. Biomarkers and microsatellite instability analysis of curettings can predict the behavior of FIGO stage I endometrial endometrioid adenocarcinoma[J]. Modern Pathology,2011,24:1262-1271.

[19]李军,王建平.肺癌支气管冲洗加肺泡灌洗液中微卫星DNA改变及其临床意义[D].山东:山东大学内科学,2002.

[20]李曼,喻喆.肺癌微卫星不稳定性与错配修复基因缺陷的相关性研究[J].肿瘤研究与临床,2011,4:227-229.

[21]戴纪刚,肖颖彬.肺癌线粒体DNA拷贝数改变和微卫星不稳定性[J].第三军医大学学报，2010,19:2134-2136.

[22]廖秀清,赵麟丰.联合检测微卫星不稳定性和p16甲基化在早期肺癌中的诊断价值[J].中国呼吸与危重监护杂志,2010,1:81-82.

[23]Takeuchi S, Koike M,Seriu T,et al. Frequent loss of heterozygosity on the long arm of chromosome 6:identification of two distinct regions of deletion in childhood acute lymphoblastic leukemia[J].Cancer Res, 1998, 58: 2618-2623.

[24]赵静,周初.T细胞非霍奇金淋巴瘤6号染色体长臂杂合性缺失的研究[J].实用医学杂志,2007,23(19):297-298.

[25]罗春英,邓飞.T细胞非霍奇金淋巴瘤微卫星不稳定性及hMSH2、hMLH1蛋白表达研究[J].广西医科大学学报,2011,4:511-514.

[26]Gamberi B,Gaidano G,Parsa N,et al.Microsatellite instability is rare in B-cell non-Hodgkin’s lymphoma[J].Blood,1997,89(3):975-979.

[27]Lee H,Kim JJ,Kim JH,et al.Microsatellite instability in gastric B-cell lymphoma[J].Korean J Gastroenterol,2006,47(3):205-212.

[28]Borie C,Colas C,Dartiques P,et al.The mechanisms underlying MMR deficiency in immunodeficiency-relate d non-Hodgkin lymphomas are different from those in other sporadic microsatellite instable neoplasms[J].Cancer,2009,125:2360-2366.

[29]Matrew R,Arora S,Mathur M,et al,Esophageal squamous cell carcinomas with DNA replication errors(RER+) are associated with p16/PBb loss and wild-type p53[J].Cancer Res Clin Oncol,2001,127:603-612.

[30]Park SW,Kim HS,Yoo NJ,et al. Mutational analysis of mononucleotide repeats in HDAC4,5,6,7,9 and 11 genes in gastric and colorectal carcin omas with microsatellite instability[J].Acta Oncologica,2011,50:317-318.

R363.2

A

1000-2715(2012)01-0080-05

[收稿2011-11-18，修回2011-12-16]

(编辑：王福军)