PTEN表达与胃癌多药耐药的相关性研究

王贵强， 陈 溉， 卫茂华，杨盛泉

胃癌是我国常见的恶性肿瘤。胃癌的发生、发展是一个多因素参与、多基因变异、多步骤发生长期演变的复杂过程。已有研究显示，胃癌的发生和发展与第10号染色体丢失的磷酸酶(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)基因的失活表达密切相关［1-2］。目前普遍认为，影响胃癌化疗效果的主要因素是多药耐药性，P糖蛋白(p-glycoprotein，P-gp)介导的多药耐药是肿瘤细胞产生多药耐药的经典途径。本研究通过检测PTEN、P-gp在胃癌、癌旁及正常组织中的表达及其相关性，探讨PTEN参与胃癌多药耐药的可能机制。

1 资料与方法

1.1 标本来源 标本来自我院2009年1月至2011年1月期间行胃癌根治切除术的51例患者，其中男23例，女28例;患者年龄36～75岁，中位年龄60岁。低分化组(低分化腺癌、未分化癌、黏液腺癌、印戒细胞癌)28例，中高分化组(中分化、高分化管状腺癌及乳头状腺癌)23例。有淋巴结转移23例，无淋巴结转移28例。浸润未超过浆膜层(T1+T2)25例，浸润超过浆膜层(T3+T4)26例。按2009年第7版UICC的TNM分期:Ⅰ期8例，Ⅱ期14例，Ⅲ期21例，Ⅳ期8例。所有患者术前未行放化疗，术后病理确诊为胃癌。每例均取胃癌组织、距肿瘤边缘＞5cm的正常组织及距肿瘤边缘0.5～1.0 cm的癌旁组织(正常及癌旁组织均经病理检查排除肿瘤累及)，以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后待用。

1.2 方法 采用SP法检测标本中PTEN、P-gp的表达，按试剂盒说明操作，多次预实验调整最佳反应条件，以已知阳性切片作为阳性对照，以0.01 mol/L PBS代替一抗作为空白对照。鼠抗人PTEN单克隆抗体、鼠抗人P-gp单克隆抗体、SP试剂盒、DAB显色剂均购于北京中杉生物技术有限公司。

1.3 结果判定 PTEN阳性为在细胞核内呈棕黄色或黄色颗粒，P-gp阳性为在细胞浆或细胞膜中呈棕褐色或黄色颗粒。每例切片选取5个区域40倍高倍镜视野，每个区域计数200个细胞，按阳性细胞占同类计数细胞的百分比为阳性面积。表达水平采用染色强度评分+阳性细胞面积评分的积分表示。染色强度分0～3级:0级为完全阴性，与背景一致;1级为弱阳性，染色淡黄色略高于背景;2级为阳性染色，呈黄色，明显高于背景;3级为强阳性染色，呈棕褐色。阳性细胞面积分4级:0级为阳性细胞面积小于10%;1级为10%～25%;2级为大于25%～50%，3级为大于50%。以积分0～2为阴性，积分≥3为阳性。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件，组间比较用χ2检验分析，因素相关性分析用Spearman等级相关分析，以P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 PTEN与P-gp蛋白的表达 PTEN与P-gp蛋白的阳性表达见图1、2。胃癌组织中PTEN表达阳性率为52.3%，显著低于癌旁组织(88.2%)和正常组织(96.1%)，χ2分别为 15.30 和 24.98，均 P ＜0.001。P-gp在胃癌组织、癌旁及正常组织中表达阳性率分别为 57.7%、51.9%、34.6%，胃癌组织中P-gp的阳性率显著高于正常组织，χ2=5.67，P ＜0.05。

2.2 PTEN与P-gp的表达与胃癌临床病理学特征的相关性 PTEN阳性表达与患者的性别及年龄无明显相关性，均P＞0.05;PTEN在胃癌中的表达与肿瘤分化程度、浸润深度、局部淋巴结转移及临床分期相关，χ2值分别为 4.65、4.46、5.55、4.46，均 P ＜0.05。P-gp在胃癌组织中的表达与患者的性别、年龄、肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及临床分期均无显著相关，均P＞0.05。

图1 PTEN在癌旁组织中的阳性表达(SP，×400)

图2 P-gp在胃癌组织中的阳性表达(SP，×400)

2.3 胃癌中PTEN表达与P-gp表达的相关性Spearman相关分析显示胃癌组织PTEN和P-gp的表达呈负相关，Spearman相关系数为 －0.42，P＜0.05，见表1。

表1 PTEN与P-gp表达的相关性

3 讨论

PTEN是具有双重磷酸酶活性的抑癌基因，通过发挥其蛋白酪氨酸磷酸酶和脂质磷酸酶活性作用，脱去多种促瘤生长因子介导的细胞内信号转导途径中的关键酶的磷酸根，降低其磷酸化水平，阻断信号转导通路而发挥抑癌作用［3］。PTEN的失活在胃癌中是一多发事件，其通过基因突变、删除、缺失、杂合性丢失、启动子甲基化而失活，进而增强蛋白激酶B、焦点粘附激酶、细胞外信号调节激酶的活性，提高肿瘤细胞的增殖、粘附、迁移能力。我们的研究显示，胃癌中PTEN的阳性率显著低于正常及癌旁组织(P＜0.05)，PTEN在癌旁组织中的阳性率低于正常组织，但无统计学差异，此结果与Yang等［2］的研究结果相似。从正常胃黏膜到胃癌的演变过程中PTEN的表达下调，其抑制肿瘤细胞增殖分化的能力降低，促进了肿瘤的发生，显示PTEN在胃癌的发生过程中起着重要作用。已有的研究表明PTEN在胃癌中的表达与 VEGF、MMPs呈负相关［4］，提示PTEN失活可提高VEGF、MMPs的表达，促进癌细胞向基质浸润及肿瘤血管的形成，为肿瘤细胞的浸润转移提供条件。我们的研究显示PTEN的表达与患者的年龄及性别无明显相关，而与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、肿瘤分化程度、pTMN分期显著相关，这表明PTEN蛋白表达水平反映了胃癌浸润、转移特性，参与了胃癌的发展，影响胃癌的预后。

P-gp是MDR-1基因的表达产物，其外排涉及肿瘤多药耐药的主要分子机制，可作为判断化疗反应的独立预后因素。我们的研究显示P-gp在胃正常、癌旁、癌组织中均有表达，癌组织显著高于正常组织，正常胃黏膜中P-gp的表达是其生理功能的一种表现，是胃黏膜暴露于外界环境中接触有毒物质后的一种保护性反应，同时也说明人类本身就存在P-gp基因的表达，即具有原发耐药性;肿瘤细胞的形成及化疗药物的使用只是增强了这种耐药性的表达，说明P-gp在胃癌的发生发展过程中也起着重要的作用。

近年的报道表明抗癌药物顺铂、多柔比星及紫杉醇等能通过增强PTEN抑癌活性而诱导肿瘤细胞的凋亡［5］，PTEN基因的活性改变可影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，由此推测PTEN失活在肿瘤化疗耐药中发挥了重要作用。我们的研究显示胃癌中PTEN的表达与P-gp的表达呈显著的负相关，提示PTEN可能参与了胃癌耐药性的形成。Han等［6］的研究显示PI3K/AKT途径是肿瘤中经常被激活的重要细胞内信号途径，该途径的激活能上调磷酸化的AKT的表达，并通过P-gp和非P-gp介导的机制来调节肿瘤的耐药性。Garcia等［7］通过分析AKT、MDR-1、NF kappa B的相关性时发现磷酸化的AKT在耐药株的细胞系中的表达高于在化疗敏感细胞系中的表达，应用抑制剂Wortannin和Ly294002能抑制P-gp的功能。PTEN是负性调控PI3K/AKT途径的抑癌基因，胃癌中PTEN的失活将提高AKT的活性，提示PTEN的失活是激活磷酸化的AKT活性的潜在机制，并可能参与胃癌的多药耐药性。Hang等［8］在转染PTEN基因后发现胃癌细胞对化疗药物的敏感性增强，并能逆转耐药细胞株的耐药性。我们的研究显示PTEN与P-gp的表达呈负相关关系，推测胃癌中PTEN的失活可能通过激活PI3K/AKT途径上调P-gp的表达，但其确切的机制仍需进一步的研究。

综上所述，PTEN失活与胃癌的发生发展密切相关，其可作为胃癌病理生物学行为的判断指标。PTEN的表达与P-gp表达呈负相关，其失活可能通过调节激活PI3K/AKT途径上调P-gp的表达而参与胃癌的多药耐药。

［1］Li YL，Tian Z，Wu DY，et al.Loss of heterozygosity on 10q23.3 and mutation of tumor suppressor gene PTEN in gastric cancer and precancerous lesions［J］.World J Gastroenterol，2005，11(2):285-288.

［2］Yang L，Kuang LG，Zheng HC，et al.PTEN encoding product:a marker for tumorigenesis and progression of gastric carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2003，9(1):35-39.

［3］Maehama T.PTEN:its deregulation and tumorigenesis［J］.Biol Pharm Bull，2007，30(9):1624-1627.

［4］Zheng H，Takahashi H，Murai Y，et al.Expressions of MMP-2，MMP-9 and VEGF are closely linked to growth，invasion，metastasis and angiogenesis of gastric carcinoma［J］.Anticancer Res，2006，26(5A):3579-3583.

［5］Schödorf T，Becker M，Göhring UJ，et al.Interaction of cisplatin，paclitaxel and adriamycin with the tumor suppressor PTEN［J］.Anticancer Drugs，2001，12(10):797-800.

［6］Han Z，Hong L，Wu K，et al.Phospho Akt mediates multidrug resistance of gastric cancer cells through regulation of P-gp，Bcl-2 and Bax［J］.J Exp Clin Cancer Res，2007，26(2):261-268.

［7］García MG，Alaniz LD，Cordo Russo RI，et al.PI3K/Akt inhibition modulates multidrug resistance and activates NF-kappaB in murine lymphoma cell lines［J］.Leuk Res，2009，33(2):288-296.

［8］Hang Y，Zhang YC，Cao Y，et al.Suppression of gastric cancer growth by adenovirus-mediated transfer of the PTEN gene［J］.World J Gastroenterol，2005，11(15):2224-2229.