急性胰腺炎细胞的死亡方式

张蓓蓓 刘晓 湛先保 李兆申

·综述与讲座·

急性胰腺炎细胞的死亡方式

张蓓蓓 刘晓 湛先保 李兆申

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)腺泡细胞有3种死亡形式，即凋亡、自噬及坏死。凋亡有依赖半胱氨酸-天冬氨酸-特异性蛋白酶(Caspase)和非依赖Capase两种信号通路，其中以前者为主。依赖Caspase通路即通过线粒体外膜渗透作用和(或)细胞表面死亡受体通路激活Capase诱导腺泡形成凋亡小体并被吞噬细胞吞噬。非依赖Caspase通路则可能是通过溶酶体蛋白(如组织蛋白酶D，CatD)的活化而导致细胞死亡[1]。自噬是非依赖于吞噬细胞的自我降解过程，大量胞质及细胞器包被于多层膜结构的自噬空泡(自体吞噬体)中，随后被溶酶体系统降解(自噬溶酶体)。凋亡及自噬均被认为是程序性细胞死亡，对AP的影响尚不明确。坏死伴有细胞成分外溢，可引发炎症反应，对机体造成严重损伤。最近对坏死是否受控也开始有不同的观点[2]。探讨3种细胞死亡类型和相互关系，以及对AP的影响有助于加深我们对AP病理生理过程的理解。

一、细胞凋亡

凋亡，即I型程序性细胞死亡，是细胞自我破坏从而维持稳态的生理过程，也称为细胞自杀。凋亡具有不同的形态学及生化特征，包括胞质皱缩、细胞器受损、细胞膜生出泡状结构、核裂解、DNA片段裂解、磷脂酰丝氨酸暴露、凋亡小体包被裂解片段、巨噬细胞或其他吞噬细胞处理裂解细胞碎片等。整个过程不会引起炎症反应[3]。凋亡失调能引起严重的后果，如癌症、神经退行性变和自身免疫疾患等[3]。在糖尿病、慢性胰腺炎、胰腺癌等胰腺疾病中凋亡都发挥了重要的作用[3]。

凋亡由细胞表面死亡受体途径或线粒体途径所诱导[3]。Caspase作为凋亡通路的核心有以下几个特征：(1)半胱氨酸残基作为催化部位活化；(2)底物天冬氨酸残基特异性裂解；(3)非活性酶原合成。Caspase底物包括：凋亡和炎症调节因子、蛋白激酶和其他信号转导调节因子、细胞质和细胞核结构蛋白、修复酶和管家酶及细胞周期调节因子等。目前已知的凋亡途径有两条：(1)外源性通路，由细胞表面受体(如FAS介导的Caspase 8或Caspase10)启动及随后Caspase 3活化而触发；(2)内源性通路，如细胞毒性T细胞使线粒体外膜渗漏，造成细胞色素C(cytochromeC，CytC)的释放并活化下游效应Capases。凋亡是主动的耗能过程，线粒体一旦不能提供足够的ATP，凋亡就会受到抑制而启动坏死。凋亡可由多种刺激诱发，研究发现Caspase通路中凋亡X-连接抑制剂(X-linked inhibitor of apoptosis，XIAP)和受体间蛋白(receptor-interacting protein，RIP)在AP细胞死亡的调节中起关键作用。大鼠雨蛙素诱导的急性水肿性胰腺炎(AEP)模型中，Caspase迅速活化，XIAP活性下降，而急性坏死性胰腺炎(ANP)模型中，Caspase被阻断，XIAP未降解，提示XIAP通过抑制凋亡加重了AP。凋亡起到保护作用，而坏死加剧了病理过程。因此，ANP时坏死多，凋亡少，而AEP时则反之[4]。

对于外源性通路，Caspase 8由死亡结构域受体与Fas相关死亡结构域(FADD)相互作用被激发而最先启动。Caspase 8的自动催化活化和死亡诱导信号复合物(DISC)寡聚体是细胞死亡启动的关键环节[3]。Caspase 10和Caspase 2也参与其中，但作用仍不清楚[3]。Caspase 8活化后有两条路径：I型通路中Caspase 3和Caspase 7加工和活化，通过裂解不同的底物，包括其他的Caspase扩大级联反应。Ⅱ型通路中Caspase 8裂解胞质促凋亡Bcl-2家族成员Bid并向线粒体转移，导致促凋亡Bcl-2家族成员Bax和Bak寡聚化后CytC被释放并诱导凋亡小体形成，其后途径与内源性相似[5-7]。

内源性通路中，Ca2+依赖性的线粒体渗透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的开放是CytC释放到胞质中的关键环节。CytC一旦被释放，凋亡肽酶激活因子1和促Caspase 9因子形成凋亡体，激活Caspase 9、Caspase 3，裂解特异凋亡靶目标引起细胞死亡。最近有证据显示缺少腺苷酸转运蛋白(adenine nucleotide translocator ，ANT)的亚型使MPTP在诱导凋亡中的作用受到质疑。环孢素D基因缺失的鼠模型不能形成环孢素A依赖的MPTP，但仍能受到不同凋亡信号的刺激而死亡[8]。

Ca2+信号的过度增高被认为是启动AP的核心[9]。目前研究认为，Ca2+浓度的振荡引发凋亡[10]，而持续的升高引发坏死[11]。生理条件下，受刺激的细胞内局部Ca2+浓度增加产生NADPH，随后该中介物燃烧ATP，使分泌减少。而细胞整体持续的Ca2+浓度增加使ATP浓度剧烈下降。Ca2+受到第二信使包括三磷酸肌醇(IP3)、烟酸腺嘌呤二核苷酸(NAADP)、环腺苷二磷酸核糖(cADPR)的精确调控，使分泌局限在腺泡细胞的顶膜侧，线粒体周围的缓冲系统限制Ca2+信号扩散到基底膜，高尔基体也可能参与其中。利用抑制剂或基因敲除动物的AP模型已证明磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)通过抑制肌浆网Ca2+ATP酶介导了Ca2+浓度的持续上升。利用Ca2+螯合剂(BAPTA)阻断Ca2+升高即可阻止CCK的强刺激、胆汁酸及乙醇诱导的胰腺腺泡细胞的酶原激活。

二、自噬

自噬至少有3种形式：(1)大分子吞噬作用；(2)分子蛋白介导的自噬；(3)小细胞自噬。自噬通常指的是大分子吞噬作用，是细胞为适应环境的自我保护现象[12]，可维持细胞功能的稳态，如蛋白和细胞器的更新。当细胞需要更多的能量时自噬会迅速上调。生理条件下饥饿可诱发自噬。目前研究酵母基因中发现超过20种自噬相关基因(ATG)参与自体吞噬体的形成。自噬降解长寿命蛋白和细胞器，为细胞再循环提供所需材料。酵母菌自噬基因缺失的突变株在无氮源的饥饿条件下不能存活即是一个例证。待降解的细胞器先被自体吞噬体包被(双层膜的囊泡)，再与次级内体(endosome)融合，最终与溶酶体融合成自噬溶酶体[13]。融合步骤依赖于溶酶体相关膜蛋白(Lamp-2)介导。自噬溶酶体中起降解作用的主要是组织蛋白酶家族(Cat)。Cat通过一系列的溶蛋白酶裂解过程被激活。首先其被加工为单链形式，再裂解为重链和轻链并形成非共价复合物(双链形式)，这标志着酶的成熟。成熟的Cat通常出现在溶酶体中，一部分也可存在于溶酶体前体。不同AP模型(精氨酸或雨蛙素)中观察到Cat L单链或双链堆积，Cat B数量下降。Cat L的作用是降解胰蛋白酶原或胰蛋白酶，而Cat B激活胰蛋白酶原。由此推测Cat L和Cat B的失衡导致了腺泡细胞早期事件的发生。利用Cat非特异抑制剂亮肽素(leupeptin)可引起腺泡细胞大的自噬空泡的堆积[14]，提示Cat在胰蛋白酶原激活和空泡形成中均有重要作用。

自噬又可分为选择性与非选择性两种形式。饥饿等应激诱发的是非选择性自噬[12]。当胞内存在高能量信号如氨基酸及胰岛素信号时可活化mTOR(一种促进蛋白合成的激酶)而抑制自噬。当mTOR活化减少时自噬上调以应对营养剥夺。而缺氧时线粒体选择性自噬(mitophagy)及非选择性自噬均存在。

自噬在AP中的作用尚未明确，其争议在于激活自噬的意义是加速细胞能量营养补充从而有益于细胞存活或及时提供ATP使细胞应激时启动凋亡以减轻损伤，还是使胰蛋白酶原激活而直接损伤腺泡。Atg 5是一种重要的自噬诱导蛋白，一项关于敲除Atg 5基因的小鼠模型的研究提出过度自噬可能诱发腺泡细胞胰蛋白酶原的激活[15]。基因敲除后CCK诱导的AP炎症程度减轻，提示自噬的破坏作用。利用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)建立AP模型发现胰蛋白酶原活化受阻。另一项实验[12]将AP模型和饥饿模型比较，发现两者都存在自噬现象，但AP模型溶酶体降解受抑，自噬延缓。自噬溶酶体降解能力的下降是由于溶酶体中的水解酶活力下降。在该研究中还证实空泡的堆积与自噬受抑相关。AP模型中的空泡在数量和体积上都较饥饿模型增大，推测空泡可能是自噬激活或自噬紊乱造成的结果。雷帕霉素(rapamycin)通过抑制阻断自噬起始阶段的激酶mTOR诱导自噬没有使胰酶活化的基础水平提高，这一现象说明自噬活化本身不能诱导胰蛋白酶的激活。利用免疫组化观察AP胰蛋白酶原激活的部位，发现自噬标记物LC3-Ⅱ和溶酶体标记物LAMP-2部分共定位于胰蛋白酶原激活肽TAP部位，这表明自噬空泡形成一个独立的区域，是胰蛋白酶原活化的部位[12]。

三、坏死

坏死是一种无凋亡和自噬特征的死亡方式，通常认为不受调控。但最近研究发现坏死的发生过程也可能受到严密调控。在损伤信号作用下，腺泡细胞线粒体功能下降、活性氧产生增强、ATP消耗、蛋白水解酶或组织蛋白酶分解蛋白和早期质膜破裂等坏死的过程均受到调控。因此，坏死也可定义为程序性细胞死亡。其依据包括：首先，涉及软骨细胞(chrondrocytes)死亡的骨生长长度的控制、小肠上皮细胞保持组织内稳态等均有坏死参与；其次，坏死由特殊质膜受体与生理配体触发，提示存在特殊信号通路介导坏死；第三，坏死信号易感性可受先天及后天因素调节，例如不同品系鼠对脑缺血的敏感性不同，不同年龄和大脑不同区域的敏感性也不同；第四，抑制一些酶能阻断坏死，提示这些酶在死亡进程中扮演确定的推助作用；第五，Caspase能改变细胞死亡形式从Ⅰ型凋亡到Ⅱ型自噬或到Ⅲ型坏死。在观察鼠胚胎肾永生细胞(IBMK细胞)时发现，抑制基因敲除促凋亡蛋白Bax和Bak或过表达抗凋亡蛋白Bcl-2，同时抑制线粒体膜渗透性作用能引起凋亡向自噬的转变。而转染组成功活化Akt蛋白激酶或基因敲除编码促自噬Beclin-1蛋白的等位基因可抑制自噬，使自噬向坏死转变[16]。小鼠胚胎成纤维细胞受依托泊苷刺激时，敲除Bax和Bak基因同时缺少自噬蛋白如Atg 5可导致细胞坏死延迟[17]。坏死可能是特殊信号转导的级联反应，也可能是凋亡受抑的表现，并推测凋亡和自噬都是在坏死基础上进化衍生出来的。在细胞急性死亡模型中，PARP、RIP1、CypD、calpains及Cat受抑可抑制坏死。在AP模型中采用恩贝酸阻断XIAP促进凋亡，可减轻坏死和炎症，此与Caspase介导的RIP1裂解相关[18]。

四、AP时自噬、凋亡、坏死之间的关系

目前有实验证实凋亡基因缺失模型中自噬阻止了坏死的发生。一项研究[19]采用乙醇和内毒素联合建立AP模型后通过检测发现Lamp-2(参与自体吞噬体与溶酶体融合)和Gramp-92(颗粒相关蛋白)等几种溶酶体膜蛋白的消失，并观察到自体吞噬体的堆积和自噬溶酶体的缺乏，降低了ATP水平，导致凋亡向坏死的转变。该研究认为内毒素诱导的AP中自噬后期进程受到抑制，导致胰腺腺泡的空泡形成。此模型进一步证实溶酶体膜蛋白在自噬形成过程中的关键作用。然而此研究并没有阐明凋亡和自噬在AP中的联系。凋亡和自噬是协同、叠加还是拮抗，以及各自导向坏死的通路尚待探讨。

自噬对凋亡促进或抑制取决于外界条件[20]。PUMA(p53-inducible BH3-only protein)或Bax诱导的线粒体选择性靶点自噬能促进凋亡[21]，而乳腺癌细胞DNA受损使自噬延缓其凋亡过程[22]。最近热休克线粒体变化的研究[19]探讨了自噬与凋亡的关系。自噬是线粒体受损后被清除的通路，热休克后线粒体去极化启动选择性自噬也称Mitophagy。Mitophagy通过减少CytC的释放和下游Caspase的活化使热休克诱导的凋亡被阻断，这证明了自噬对凋亡的抑制作用及对细胞的保护角色。Bcl-2家族在自噬的调节方面扮演双重角色。抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w和Mcl-1抑制自噬，而促凋亡蛋白BNIP3、Bad、Bik、Noxa、Puma和BimEL能诱导自噬[23]。然而不同模型中自噬及凋亡的意义并不相同。在一项研究中专门对比了雨蛙素及精氨酸诱导的AP模型中凋亡蛋白及自噬蛋白的含量，结果发现促凋亡基因Bax、Bcl-1及凋亡相关蛋白Capn-2、5在雨蛙素模型中明显高于精氨酸组，抗凋亡蛋白Bcl-2则较精氨酸组明显减少。微管相关蛋白1轻链Map1lc3a(自噬标记蛋白)在雨蛙素组也高于精氨酸组[25]。这说明雨蛙素模型易于引发凋亡和自噬。在一项乙醇联合脂多糖LPS诱导的AP模型中观察到，乙醇联合LPS与LPS单纯注射相比，抑制了Caspase 3、Caspase 9的活化，即抑制了凋亡，同时检测到LC3-Ⅱ增加。微管相关蛋白1轻链(LC3-Ⅰ)通常存在于胞质中，自噬时通过palmitoylate(棕榈酰化)形成膜结合LC3-Ⅱ并与自体吞噬体相关，意味着自体吞噬体的堆积，即向自体溶酶体的转化受到干扰。这说明LPS联合乙醇模型中凋亡和自噬同时受到抑制[25]。

综上所述，AP腺泡细胞受到各种打击，通过不同通路产生相应效应，最终导致细胞死亡。不同的死亡方式对机体预后影响差别很大。在不能避免病因打击的情况下，采取哪些方法诱导腺泡细胞减少炎症反应是应努力解决的难题。凋亡、自噬及坏死被认为是AP中的3种细胞死亡形式，坏死目前被认为是炎症的启动者，而凋亡和自噬对腺泡有保护作用。鉴于三者间的关系错综复杂，阐明并调节细胞死亡信号向凋亡和自噬转变是探索新的AP防治手段的方向。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.026

上海市自然科学基金课题资助(18ZR1447600)

200433 上海，第二军医大学长海医院消化内科

李兆申，Email：zhsli@81890.net

2011-05-23)

(本文编辑：屠振兴)