MiRNAs在恶性肿瘤诊断及治疗研究中的新进展

刘雅歆， 程静新

miRNAs是一类大小约19～25个核苷酸的内源性非编码小分子RNAs，广泛存在于真核生物中。近年来，miRNAs与肿瘤的关系成为研究的热点，成为21世纪的“明星分子”。不少研究结果表明，miRNAs既可以是癌基因，也可以是抑癌基因，有望成为恶性肿瘤早期诊断的分子标志物及治疗的药物靶点。本文现就miRNAs在恶性肿瘤诊断及治疗方面的研究新进展做一综述。

1 miRNAs的特点

1.1 miRNAs的发现 1993年 Lee等［1］在研究线虫发育缺陷时，首次发现了lin-4，2000年Reinhart等在对线虫的发育调控研究中又发现了let-7，之后又陆续发现了大量类似lin-4的小RNA基因，被统一命名为miRNA。miRNAs广泛存在于真核生物中，其本身不具有开放阅读框(ORF)，成熟的miRNAs，5'端有一个磷酸基团(－ HPO4)，3'端为羟基(－OH)。据估计，人类基因组中miRNAs的种类约有1 000种，近30%的人类基因受miRNAs的调控。越来越多的证据证明，miRNAs在细胞增殖、凋亡、分化、生殖以及肿瘤发病机制中都具有一定的调控作用。超过50%的人类miRNAs基因定位于肿瘤相关的区域或脆弱区域［2］。

1.2 miRNAs的生物合成 目前认为编码miRNA的基因首先在核糖核苷酸酶Ⅱ(ribonucleaseⅡ，RNaseⅡ)的作用下在胞核内形成最初的miRNA(pri-miRNA)，pri-miRNA在Drosha酶的作用下形成发夹状前体 miRNA(pre-miRNA)，pre-miRNA在Ran-GTP和转运蛋白Exportin-5的协同作用下转运出核进入胞浆，随后在Dicer酶的剪切作用下切割成双链miRNA，其中的一条RNA链进入核蛋白复合体，形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，这条单链 RNA称为成熟miRNA(mature-miRNA)，而另一条RNA单链则被降解［3-4］。目前普遍认为miRNA主要通过两种机制介导转录后的基因调节:一种是mRNA的降解，另一种是翻译抑制。当miRNA和编码蛋白的mRNA的3'UTR(3'非编码区)完全或几乎完全配对时，RISC阻断mRNA的翻译，并导致mRNA的降解，这种机制多见于植物中［5］。然而，大多数情况下miRNA并不导致靶mRNA降解，而是通过不完全的碱基配对与mRNA在一个类似于或等同于RNA干扰途径中使用的RISC复合物中，在转录后水平抑制基因翻译。通过这种机制发挥作用的miRNA仅降低其靶基因的蛋白表达水平，靶基因的mRNA水平几乎不发生改变［6-8］。

1.3 miRNA常用检测方法 由于成熟的miRNAs很短，在细胞中的表达量不高，所以对于miRNA的检测完全不同于mRNA、rRNA等检测。目前关于miRNA常用的检测方法有RNA印迹分析法(Northern blot)、实时荧光定量 PCR(Real-time PCR，RTPCR)和微阵列芯片等。(1)Northern blot是最经典的真核生物RNA检测方法，常用来评价其他miRNA检测方法的可靠性，优点是可以同时显示被检测miRNA相对分子质量和丰度两个方面的信息，这是其它实验方法无法比拟的;缺点是费时、费力、实验危险性增加(与RNA杂交的特异性探针都是放射性元素标记的)。(2)RT-PCR可以满足大多数miRNA在组织及细胞中表达水平的研究，优点是特异性及灵敏度高;缺点在于价格昂贵，在筛选miRNA的过程中无法做到同时检测成千上万个样品。(3)微阵列芯片(microarray)可以在短时间内快速、高通量的分析大量的生物分子，所需样本量小，目前被广泛用于初筛;缺点是特异性及灵敏度不高。所以检测miRNA需要结合具体的实验设计和各种检测方法的优缺点综合考虑。

2 miRNA与肿瘤诊断

随着肿瘤总发病率持续上升，针对高发恶性肿瘤开展筛查和早期诊断工作，选择一种特异度、灵敏度高的早期诊断标记物显得尤为重要。随着对miRNA研究的不断深入，大多数研究学者认为miRNA很有可能作为恶性肿瘤早期诊断的分子标志物应用于临床。肺癌是全世界发病率最高的恶性肿瘤，其中以鳞癌最为常见。Raponi等［9］证明 miR-146b诊断鳞癌具有比较高的准确性。Lebanony等［10］发现miR-205可作为诊断鳞癌的生物标记物，在癌组织中具有极高的特异性和敏感性。乳腺癌是危害女性健康的最常见恶性肿瘤之一，Van等［11］和Rodríguez-González等［12］鉴定了 13 种 miRNAs 在炎性乳腺癌和非炎性乳腺癌组织中的表达情况，其中4种miRNAs的靶基因与预测相同，3种miRNAs在炎性乳腺癌中过表达，9种miRNAs在炎性乳腺癌中低表达，为乳腺癌的诊断提供了新的重要依据。Chan等［13］在胃癌组织与正常组织miR-21的表达研究中发现，92%(34/37)的胃癌样本中miR-21过表达，但miR-21的过表达与不良预后不相关，不反映胃癌复发与预后的情况。Guo等［14］报道了11种在胃癌中显著高表达的miRNAs，提示这些miRNAs很可能在胃癌的早期诊断中发挥作用。Wang等［15］在对98例结直肠癌的研究中发现，癌组织中miR-31的表达明显高于正常组织，miR-145在结肠癌和直肠癌中都呈下调表达，而miR-143只在结肠癌中下调。此研究不仅有助于直结肠癌的诊断，并且对结肠癌和直肠癌也有一定的区分意义。Ng等［16］通过研究证实血浆中的miR-92可以作为筛查结直肠癌的重要分子标志物。Schmitz等［17］通过研究发现miR-181b和miR-21在结肠腺瘤中呈高表达，在结肠息肉中的表达位居其次，而在正常结肠黏膜中的表达最少。Li等［18］研究发现，在结肠癌组织中明显低表达的miR-126可以抑制肿瘤细胞的周期，在结肠癌的诊断和治疗中可作为一种抑癌基因发挥作用。Guo等［19］利用miRNAs微阵列芯片技术对食管癌组织进行了miRNAs表达谱分析，得出能够区分恶性和邻近正常组织的7种miRNAs，这些miRNAs将有望成为食管癌重要的诊断性分子标志物。

3 miRNAs与肿瘤治疗

随着后基因组时代的到来，靶向治疗在肿瘤药物治疗方面迅速兴起。miRNAs即可以作为癌基因促进恶性肿瘤的发生与生长，又可以作为抑癌基因抑制肿瘤的发生与发展。大量研究结果提示miRNAs是包括肿瘤在内的许多疾病的药物治疗靶点，所以通过抑制作为癌基因的miRNAs，或者导入作为抑癌基因的miRNAs来抑制肿瘤的生长。Let-7是目前研究最为广泛的miRNAs之一，在多种肿瘤中表达下调，普遍认为其功能抑制与肿瘤的发生发展关系密切。Fei等［20］报道运用anti-miRNA技术，在A549细胞内转染anti-miR-21、anti-miR-16和anti-miR-181a后，细胞的生长均受到抑制。Weiss等［21］研究发现非小细胞肺癌(NSCLC)组织中经常发生miR-128b杂合性缺失，miR-128b以表皮生长因子受体为靶基因参与调控其在NSCLC的表达水平，与患者对吉非替尼的反应及生存有关。Pan等［22］研究发现，在乳腺癌细胞株中miR-328调控乳腺癌耐药基因ABCG表达并增加耐药细胞对米托蒽醌的敏感性。在对雌激素拮抗剂耐药的乳腺癌细胞株研究中，Xin等［23］进行了 miRNAs和 mRNAs双重芯片的对照研究，结合生物信息学分析发现，乳腺癌对雌激素拮抗剂耐药与miRNAs表达密切相关，并且预测的靶基因是耐药相关信号通路中的重要成员。Kong等［24］研究证实，过表达的 miR-155通过抑制FOXO3表达，促进肿瘤存活与增殖，并降低肿瘤对化疗药物的敏感性。Xia等［25］在胃癌MDR细胞株的研究中发现miR-15b和miR-16都表达下调，当上调其表达时miR-15b和miR-16以BCL-2为靶基因诱导凋亡，并恢复耐药细胞的化疗敏感性。Ji等［26］研究发现miR-34能恢复P53缺陷的胃癌细胞对细胞毒药物的敏感性，通过靶基因BCL-2诱导凋亡，从而恢复 P53的功能。Fujita等［27］研究发现miR-34a可以下调P53基因缺陷的前列腺癌细胞STRT1基因的表达，诱导凋亡导致细胞周期停滞以及生长抑制，恢复喜树碱的化疗敏感性。Yang等［28］研究发现用AKT抑制剂或直接抑制miR-214对PTEN的靶调节作用，可以降低miR-214通过PTEN/AKT信号通路诱导的卵巢癌耐药细胞的生存率和对顺铂的抵抗性，此研究结果提示这些方法可以应用到耐药性卵巢癌的治疗中，以增加卵巢癌患者对化疗药物的敏感性。Zhu等［29］研究发现，miR-451可以上调MDR1的表达从而增加卵巢癌细胞的化疗耐药性。Sorrentino等［30］研究发现，miR-335的下调与卵巢癌的化疗耐药性有关。Boren等［31］研究发现miR-106a的靶基因MAP4与卵巢癌对紫杉醇敏感性有关;miR-431的靶基因VIM与雌激素受体阳性的卵巢癌患者对激素治疗的反应性有关;miR-21的靶基因KLF5与P53基因独立凋亡通路有关，其上调能够增加癌细胞的化疗药物耐药性。Yao等［32］在宫颈癌HeLa细胞的试验中发现，抑制miR-21可以明显抑制癌细胞的增殖，是通过上调肿瘤抑制基因PDCD4引起的，表明miR-21是宫颈癌的抑癌基因，并且可能是一个潜在的治疗靶点。Lee等［33］对一些表达差异的miRNAs与宫颈癌淋巴转移及化疗敏感性之间的关系做了进一步的研究，在31例早期浸润性宫颈鳞癌中，未发现miRNAs与宫颈癌的临床分期、肿瘤大小及复发相关，但发现miR-127在淋巴转移患者中表达显著升高(P=0.006)，因此推测miR-127可能是浸润性宫颈癌淋巴转移的分子标志物;其同时将反义miR-199a转染入宫颈癌细胞株(SiHa和ME180)中，结果发现细胞生长受到抑制，而顺铂联合反义miR-199a，对宫颈癌细胞的生长抑制作用更明显，并且存在着剂量效应关系，认为顺铂引起的DNA损伤可能增强反义miR-199a抑制细胞生长的能力，miR-199a可能是宫颈癌治疗的一个潜在靶标。

4 结语

miRNA这个21世纪最耀眼的分子，目前在恶性肿瘤中发挥的作用还未完全阐明，仍需进一步深入研究，把miRNA运用到肿瘤的诊断、治疗将会是一个长期的过程。需要对miRNAs发生改变的基因进行全基因组的分析;对人类不同肿瘤中的拷贝数的改变的识别;对肿瘤抑制基因或者是致癌miRNAs的推定等［34］。随着研究的不断进展，miRNA在恶性肿瘤发生发展中扮演的角色将会更加明了，这类非编码单链小分子RNA的功能、作用机制、调控网络等将会更加明确，miRNA在恶性肿瘤诊断、治疗方面将会发挥更大的价值，为恶性肿瘤的综合防治发挥不可估量的作用。

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