绿脓杆菌肺炎动物模型建立与影像学评价方法的初步探索*

第二军医大学附属长征医院影像科（上海 200003）

李 斌 朱冬青 刘洪超 于 红 刘士远

肺部感染中的医院获得性肺炎（Hospital-acquired pneumonia,HAP）由于症状被基础疾病或所用药物掩盖、病原学标本易被污染，诊断存在一定困难和延迟性，死亡率较高。绿脓杆菌是HAP特别是ICU患者肺炎的主要院内病原菌，可能在人体潮湿部位如会阴部、腋窝、耳朵等处发生定植，并在抗生素治疗中易变异而形成多重耐药，所以在临床存在过度治疗或治疗不佳的问题。因此我们采用喷雾吸入法来建立家兔绿脓杆菌肺炎模型，以期为绿脓杆菌肺炎尤其是呼吸机相关肺炎的研究提供可行的动物模型基础。

材料与方法

1.1 实验动物与细菌 健康新西兰大白兔24只，兔龄6-10个月，体重2.0-2.3kg，雌雄不拘，由上海市公共卫生临床中心动物实验中心提供。临床分离的绿脓杆菌，经VITEX微生物自动分析仪及药敏鉴定，由上海长征医院呼吸科实验室提供。

1.2 试剂 普通琼脂培养基；MH肉汤；0.9%灭菌生理盐水；戊巴比妥钠。

1.3 主要仪器设备 普通光学显微镜（日本 Olympuls），CT（Somatom Sensation 16排螺旋CT），喷雾吸入器，病理切片机，细菌培养箱，麦氏比浊仪。

1.4 实验方法

①细菌培养：将粘液型绿脓杆菌接种于琼脂培养基培养后常规方法保存。挑取4℃保存的菌落少许，置于MH肉汤中37℃孵育过夜。配置为0.5个麦氏单位（相当于1.5X108CFU/ml）的PA菌悬液。新鲜菌悬液使用当天制备。

②动物分组：新西兰兔经1周饲养后，按体重随机分为2组，实验组（A组）12只，对照组（B组）12只，置于上海市公共卫生临床中心P2实验室动物房内分笼饲养。

③麻醉和实验处理：经耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠lml/kg麻醉家兔。实验组采用喷雾吸入器，使每只家兔隔日吸入1.5X108CFU/ml的菌悬液1.5ml，35天后停止喷雾吸入操作。对照组用同样方法使家兔吸入l.5ml无菌生理盐水。

④处理后病程动态观察及监测：处理后定期观察动物的状态、体重、体温及血象变化。喷雾吸菌前所有兔行胸部CT扫描排除有病变兔，接种后隔日一次将所有当时存活的家兔CT扫描观察病变。采用Sensation 16层螺旋CT机。使用儿童头部扫描SFOV，螺旋扫描，床进15mm/周，动物俯卧位，头先进；扫描条件：120KV,200mA；DFOV选择100-120mm；扫描模式：1.0mm×16；肺算法(60)和标准算法重建（40）；常规层厚：3mm。

⑤病理学观察：实验组家兔均待其自然死亡，最后处死对照组家兔。剖胸取出肺制作病理切片，行HE染色镜下观察。实验组兔肺标本行肺组织匀浆细菌培养鉴定。

1.5 统计方法 采用SPSS18.0软件进行统计学处理。P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

2.1 存活时间 实验组动物存活时间21-38天不等，平均存活时间为24.9天。有2只兔麻醉意外死亡，其余兔自然死亡时均形成不同程度的绿脓杆菌肺部感染。

2.2 观察项目 A组新西兰兔早期有明显寒颤、发热、喘息急促、亢奋恐慌，后期出现反应迟钝、毛发粗糙黯淡、营养状态差，平均体重下降明显。B组新西兰兔未见明显异常。经耳缘静脉采血送检实验室检查，A组新西兰兔经处理后外周血白细胞总数显著升高，B组未见明显改变。

2.4 胸部CT扫描 A组胸部CT出现斑片状模糊影、支气管充气征、片状实变、结节影、胸膜增厚等肺部感染改变，少数出现支气管扩张(图1、2)。B组胸部CT未见明显异常。

2.5 肺组织匀浆细菌培养鉴定 A组兔死亡后取病变肺组织进行匀浆，于普通琼脂培养基37℃上细菌培养24小时后，根据培养、形态及生化特性可鉴定致病菌为绿脓杆菌（图3）。

2.6 病理学观察

A组：吸入PA菌液后第21-28天死亡家兔肺脏表现有充血水肿，体积增大或正常，表面可见结节样脓肿灶及出血点，部分可见胸腔积液(图4)。第28天-35天死亡家兔的肺脏出血及脓肿灶减小，部分出现空洞性病变。第36后死亡的家兔肺脏体积减小，质地轻度变硬(图5)。A组HE染色后镜下可见较多杆样细菌菌落，部分成对或短链状排列（图6）。第21-28天肺泡腔内大量出血、渗出，中性粒细胞浸润、肺组织内小脓肿形成，肺泡壁小血管扩张充血（图7）。第21-28天有肺组织实变伴周围肺气肿（图8）、细支气管壁炎细胞浸润，部分纤毛倒伏、脱落的表现。第36天后死亡兔的肺泡间隔增厚，肺间质大量淋巴细胞浸润，以淋巴细胞为主（图9）。

B组：吸入无菌生理盐水的对照组动物，肺脏大体标本外观无异常，镜下细支气管以及肺泡结构正常，肺泡腔内未见炎性渗出。但是其中有2只肺间质内少到中量炎细胞浸润。

讨 论

医院获得性肺炎（HAP）的病原微生物以革兰阴性杆菌为主（占50-70%），国内外报道均以铜绿假单胞菌绿占首位[2]。铜绿假单胞菌（又称绿脓杆菌）属于条件致病菌，广泛存在于湿润的自然环境、机体体表及与外界相通的腔道内，可在人体呼吸道、会阴部、 腋窝等处定植。机械通气患者的下呼吸道、烧伤患者的皮肤、使用广谱抗生素治疗患者的黏膜皮肤等处都可有PA的定植[3]。由于该细菌表面有一层生物被膜，不易被吞噬细胞吞噬和抗生素抗生素渗透杀灭，且绿脓杆菌天然有染色体介导的多重耐药特性，在使用抗菌药后易发生获得性耐药，是下呼吸道感染难治性常见致病菌[4]。院内感染患者基础疾病较多，免疫力低下，加上气管切开、插管、机械通气和慢性阻塞性肺部疾病等造成的支气管粘膜纤毛机制缺陷、功能不全的因素，造成黏附于上皮细胞的绿脓杆菌不能被有效地捕获或趋送，为绿脓杆菌的长期定植创造了条件[5]。一旦发生定植就不易清除，可形成慢性炎症。

目前肺部感染动物模型的肺部细菌接种常见方法有气管切开术注入、气管插管注入、雾化吸入、经皮气管穿刺注入、经鼻咽滴入等方法[6,7]。Cash等[8]学者首先报道了小鼠肺部铜绿假单胞菌慢性感染模型。他们将小鼠气管切开后，进行插管注入铜绿假单胞菌的琼脂包裹体，成功地将细菌接种至小鼠肺部造成感染。有学者使用免疫抑制小鼠气管插管接种粘液型PA菌，发现免疫抑制状态下PA菌能导致多器官严重的急性炎症反应[9]。国内有学者曾采用雾化吸入法对老龄家兔反复感染绿脓杆菌，建立了家兔稳定的慢性绿脓杆菌肺部感染模型[10]。但是气管切开易造成伤口感染、出血较多等并发症，气管插管有创伤性风险且操作相对复杂，经皮气管穿刺注菌的准确定位一定程度上依赖于操作手法娴熟与否。操作易造成其他病原菌混合感染并且术后动物生存时间较短。考虑到上述方法的创伤性、操作性，而本研究使用免疫正常的新西兰兔，通过经鼻喷雾吸入方式接种细菌，更安全、真实的模拟了绿脓杆菌呼吸道感染的自然途径与急慢性病程，建立了家兔绿脓杆菌肺炎急慢性病程演变模型，并以影像学、病理学及病原微生物学三方面作为造模成功判断标准。

本研究结果表明，接种PA菌悬液后，多数动物早期出现了诸如高热、外周血白细胞总数升高的急性细菌感染症状和出血、肺水肿、中性粒细胞浸润、脓肿灶形成的病理改变。随着细菌的反复接种，逐渐出现较多的慢性炎症及在慢性炎症基础上急性发作的病理改变。停止吸菌后这种慢性炎症改变长时间持续存在，出现非可逆性病理变化的原因可能是PA菌可能以生物被摸的形式长期存活于呼吸道和肺组织表面，与有关文献报道的临床情况相符。病理镜下观察显示，吸入PA菌液后第21-28天肺部急性炎性病理改变，35天后以慢性炎症病理变化为主。肺组织匀浆细菌培养结果表明家兔肺部感染的致病菌可定性为绿脓杆菌。在肺炎早期排查、辅助定性诊断、病程监测及预后判断中影像学起着重要作用，本研究中吸菌后第7天实验组1号兔胸部CT可见双上肺有明显的斑片状密度增高影，并见支气管充气征，从而说明CT对家兔绿脓杆菌肺炎的早期诊断是有价值的[11,12]。

本实验通过采用喷雾吸入方法建立了家兔绿脓杆菌肺炎模型，并以影像学、病理学及微生物学标准，证实了绿脓杆菌能在新西兰兔体内造成急慢性感染病程中相应的病理改变，与在人体的致病机制有明显的相似性，因此可以用于绿脓杆菌肺部感染的发病机制、病理改变、药物疗效观察以及诊断、治疗的研究。

1.中华医学会呼吸病学分会. 医院获得性肺炎诊断和治疗指南(草案)[J]. 中华结核和呼吸杂志,1999,22(4):201-203.

2.Ewig S, Torres A. Infections of the lung with Pseudomonas aeruginosa[J].Respiratory infections,2001:377-391.

3.小林宏行，雷雨. 细菌菌膜的基础与临床[J]. 中国临床药理学杂志,1999,15(4):299-307.

4.Pearson J, Feldman M. Pseudomonas aeruginosa cell-to-cell signaling is required for virulence in a model of acute pulmonary infection[J].Infec Immun,2000,68:4331-4334.

5.蔡文训,张卫星,罗华,等. 重症监护病房呼吸机相关性肺炎的菌群分布及治疗[J].罕少疾病杂志,2005,12(6):1-4.

6.Lapae S, Guerreio D, Nable B, et al.Immunopathology of experimental bronchiectasis[J]. A J of Respiratory Cell and Molecular Biology,1989,4:297-308.

7.Cash H A, Woods D E, Mccullough B,et al. A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa[J]. Am. Rev.Respir. Dis,1979,19:453-459.

8.李华强，张文俊，等. 免疫低下时绿脓杆菌肺炎大鼠肠源性感染的实验研究[J]. 中国实用儿科杂志,2001,16(5):286-288.

9.李鸿雁，夏前明，罗克枢，等. 老龄家兔慢性铜绿假单胞菌肺部感染的实验研究[J]. 西南国防医药,2005,15(2):126-129.

10.Yanagifara K, Tomono K, Sawai T K.combination therapy for chronic Pseudomonas aeruginosa respiratory infection associated with biofilm formation[J]. Antimicrob Chemother,2000,46(1):69-72.

11.刘士远，谢丽璇. 影像学在肺部感染诊断中的地位[J]. 中国医学计算机成像杂志,2010(05).

12.陈碧华,刘晋新,甘清鑫,等. 艾滋病合并肺孢子菌肺炎的螺旋CT表现分析[J]. 中国CT和MRI杂志,2009,7(1):30-31.