自体外周血单个核细胞移植对下肢动脉硬化闭塞症的治疗

王晶莹 罗玉贤 王兆娜 田惠 胡雅萍 王志波 谢绍建

严重下肢动脉硬化闭塞症的治疗一直是世界性的难题。治疗性血管生成是近年来发展的一项新技术。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMNCs)中存在能分化为血管内皮细胞的前体细胞-血管内皮祖细胞(endothelia progenitor cell，EPC)，且可分泌多种血管生成因子。因此我们设计了经血管腔内途径移植全部自体PBMNCs治疗下肢缺血性疾病的临床研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本院2004年12月至2008年6月期间收治的晚期下肢动脉硬化闭塞症患者125例，均有有不同程度肢冷、间歇性跛行及下肢溃疡，为中、重度以上下肢缺血。均经数字减影血管造影(DSA)证实，动脉狭窄或闭塞部位以腘动脉远端为重且远端无流出道。经正规袪聚、降糖、降脂及扩血管药物治疗无效，症状进行性加重，濒临截肢。

1.2 方法

1.2.1 单个核细胞动员及分离:予G-CSF(金磊赛强，长春金磊药业公司)300 μg肌内注射，2次/d，连用 3 d，第 3天用AS104血细胞分离机(Fresenius Medical Care，Japan)单独采集和分离单个核细胞，配制成50 ml的细胞混悬液供移植用。

1.2.2 经皮球囊扩张成形术:于第3天在导管室应用3×120 mm Amphirion Deep球囊(Invatec，Italy)扩张狭窄动脉，同时将分离的PBMNCs通过鞘管动脉腔内注入(图1)。

1.2.3 并发症防治:动员过程中为避免因白细胞增多或高凝状态导致急性心脑血管意外，用低分子肝素(海普宁，江苏江山制药)5 000 U皮下注射，2次/d，共5 d。细胞注射后，为预防感染，用头孢呋辛钠2.0 g加入0.9%氯化钠溶液100 ml中静脉滴注，2 次/d，共3 d。

1.2.4 观察指标:观察肢冷、间歇性跛行或静息痛及下肢溃疡愈合情况，测量跛行距离及踝肱指数。

1.3 随访 所有患者均于移植后1、6及12个月随访。观察肢冷、间歇性跛行或静息痛及下肢溃疡愈合情况，测量跛行距离及踝肱指数，磁共振血管成像(MRA)作为影像学随访，所有患者均拒绝行DSA检查。

1.4 统计学分析应用SPSS 11.5统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 症状与体征 PBMNCs移植后3 d，患肢冷感即有不同程度改善，至6个月随访未见恶化。跛行距离入院时为(24±14.75)m，1 个月时提高到(139 ±52.73)m(P=0.008)，6 个月时提高到(406±155.34)m(P=0.006)，12 个月时为(642 ±224.10)m(P=0.004)。见表1。溃疡于移植后明显好转，1～3个月逐渐愈合(图2)。

2.2 踝肱指数测定 入院时为0.60±0.07，PBMNCs移植后1 个月提高到 0.84 ±0.11(P=0.009)，6 个月时略有下降，为0.78 ±0.08(P=0.009)，12 个月时继续下降，为 0.70 ±0.07(P=0.034)，但仍略高于入院时的水平。见表1。

2.3 MRA检查 PBMNCs移植前与6个月随访时显示胫前、胫后或腓动脉狭窄或闭塞不同程度改善(图3)。

2.4 并发症与不良反应 PBMNCs移植前后未出现任何并发症和不良反应。

3 讨论

近年来，下肢动脉硬化闭塞症所致下肢缺血性疾病明显增多，相当一部分患者将发展为肢体坏疽，最终导致截肢。以往主要采用药物、血管腔内介入及手术搭桥治疗，但疾病往往慢性进展，尤其对腘动脉远端小动脉及远端流出道差的患者，目前尚无有效的治疗方法。

表1 PBMNCs移植前后跛行距离和踝肱指数变化情况 n=125，x¯±s

图1 经皮球囊扩张成形术前DSA示胫后动脉起始部以远长段闭塞

图2 术中3×120 mm Deep球囊扩张成 形，PBMNCs腔内注射

图3 术后DSA示胫后动脉通畅，成形良好，并可见侧枝开放

治疗性血管生成是由Hockel等于1993年首先提出。1997年Asahara等［1］首次证明出生后外周血中存在EPC，EPC主要存在于骨髓，少量存在于外周血中。实验证实EPC不仅参与胚胎血管生成，而且也参与出生后的血管发生过程。因而近年来出现通过补充EPC来治疗缺血性疾病的血管新生疗法，并取得了一定效果［2］。但骨髓采集需全身麻醉而且采髓量较大，对患者的全身情况要求高，部分患者心理上难以接受。PBMNCs中存在EPC，G-CSF能将骨髓中的EPC动员到外周血循环。最近研究表明骨髓干细胞移植后可促进VEGF和bFGF等血管生成因子的分泌，揭示了细胞因子移植比细胞移植可能有更好的疗效［3］。因为骨髓源性及一些非骨髓源性的单个核细胞也具有内皮细胞分化的潜能且均可分泌这些细胞因子，因此我们设计并采用了移植G-CSF动员后全部自体PBMNCs治疗下肢缺血性疾病的方法，这也许比单独种植EPC有更好的疗效，虽然目前尚无对照实验。

本组125例患者移植后通过12个月观察，患肢冷感、间歇性跛行或静息痛等临床症状不同程度好转，溃疡逐渐愈合，踝肱指数短期明显提升。有报道G-CSF动员可出现白细胞增多或高凝状态而有可能诱发急性心脑血管意外，我们在动员过程中同时使用低分子肝素，患者未出现这些并发症。患者移植后也未出现任何移植相关并发症和不良反应，初步结果表明我们设计的治疗方案是安全、有效的，PBMNCs移植能一定程度改善PAD患者下肢的血液供应。其可能的疗效机制包括在移植局部提供EPC和移植细胞在局部释放多种血管生成因子，从而直接或间接地促进内皮细胞增生、迁移，在阻塞动脉远端形成新的血管，通过“分子搭桥”为缺血组织增加血供。Kalka等［4］研究发现肢体缺血的治疗应重视EPC在缺血组织的归巢和在原位分化，我们采用经血管腔内途径直接注入PBMNCs至缺血部位的方法，一方面可解决此问题，另一方面通过增加缺血组织的局部血供来促进溃疡愈合。

采用PBMNCs移植的优点在于收集数量比先前报道的骨髓来源的多［5］，而且可方便的反复连续进行，尽管目前最佳移植数量仍不清楚。通过随访发现:ABI几乎于12个月后恢复至诊疗前的水平，但跛行距离却显示持续好转，这说明ABI可能并不能真实反映外周循环改善程度。目前仍无评价移植后血管再生程度的客观及可靠指标。

膝下血管扩张成形术能够促进足部血运重建及侧枝循环建立，降低截肢平面，并可重复操作，并发症少。虽然再狭窄率仍很高，但因其是一个渐进的过程，且可以迅速改善肢体血供，为患足溃疡愈合赢得了时间，随着再狭窄的形成，肢体侧枝循环亦随之代偿建立［6］。在此基础上联合PBMNCs移植，对侧枝循环建立与开放有很大的促进及放大作用。这也是采用血管腔内途径治疗的优势所在。

跛行距离是患者从开始行走到出现疼痛时的行程，是下肢缺血的主要临床表现，具有一定主观性。ABI是踝动脉压与肱动脉压的比值，作为一项无创检查，被广泛用来评价下肢动脉缺血程度，但由于ABI反映的是下肢主干动脉的血液灌注情况，对侧枝循环改善程度反映不敏感，所以并不能真实反映外周循环综合改善程度。两项指标的结合，可以从主观和客观两个角度更好的综合评价PBMNCs移植的效果。通过12个月随访发现:移植后患者跛行距离持续延长，而ABI短期提升明显，但此后逐渐下降，说明血管腔内成形术在治疗初期对下肢主干动脉缺血改善作用明显，随着时间延长，主干动脉会发生不同程度再狭窄，而PBMNCs的“分子搭桥”作用则日益凸显，通过新生侧枝循环建立为缺血部位供血，表现在临床上就是跛行距离持续延长，这也是PBMNCs移植的价值所在。目前仍无评价移植后血管再生程度的客观及可靠指标。采用PBMNCs移植的优点在于收集数量比先前报道的骨髓来源的多，而且可方便的反复连续进行。

总之，采用动员后的PBMNCs经血管腔内途径移植治疗下肢动脉硬化闭塞症，具有微创、安全、并发症少、可重复等优点，值得进一步深入研究。

1 Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.Science，1997，275:964-967.

2 Gallagher KA，Goldstein LJ，Thom SR，et al.Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing.Vascular，2006，14:328-337.

3 Ziegelhoeffer T，Fernandez B，Kostin S，et al.Bone marrow-derived cells do not incorporate into the adult growing vasculature.Circ Res，2004，94:230-238.

4 Kalka C，Masuda H，Takahashi T，et al.Vascular endothelial growth factor(165)gene transfer augments circulating endothelial progenitor cells in human subjects.Circ Res，2000，86:1198-1202.

5 Saigawa T，Kato K，Ozawa T，et al.Clinical application of bone marrow implantation in patients with arteriosclerosis obliterans，and the association between efficacy and the number of implanted bone marrow cells.Circ J，2004，68:1189-1193.

6 顾福杭，罗玉贤，王雪平，等.血管腔内成形术联合肝素注射疗法治疗严重糖尿病足.山东医药，2009，49:45-46.