高效液相色谱法测定家兔血浆中丹参素的含量

梁岩冰，田玉琴

（1.河北大学药学院，河北 保定071002；2.河北北方学院，河北 张家口075000）

丹参素 ［D （＋）－β－（3，4－二羟基苯基）－乳酸］是活血化淤中药丹参的主要有效成分之一，具有保护心肌缺血、拮抗动脉粥样硬化、抗血栓、改善微循环、保护肝脏、抗菌抗炎、抗肿瘤等作用［1］.药材中丹参素的含量测定多有报道［2－4］，但丹参素在家兔血浆中的含量测定还未见报道.本实验建立了以液－液萃取为前处理的高效液相色谱法测定家兔血浆中丹参素的含量，血浆经酸化后用乙酸乙酯萃取，效果较好.

1 仪器与试剂

岛津2010A高效液相色谱仪，包括SPD－M10AVP紫外检测器、SIL－10 Advp自动进样器；YDQ－01 A型氮吹仪 （宁波亚福仪表制造有限公司）；SZ－97 A自动三重水蒸馏器 （上海亚荣生化仪器厂）；Sartorius万分之一电子分析天平 （塞多利斯科学仪器有限公司）；UV2100紫外可见分光光度计 （深圳市凯铭杰仪器设备有限公司）；丹参素钠标准品 （99.2%）购于南京泽朗公司；甲醇为色谱纯 （上海梯希爱化成工业发展有限公司）；其他试剂均为国产分析纯；实验用水均为三重蒸馏水.

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：YMC－PACK ODS－A （150 mm×4.6 mm，5μm）；柱温：40℃；流动相：甲醇—0.5%冰醋酸 （1∶8 v／v）；流速：1.0 mL／min；检测波长：281 n m；进样量：20μL.

2.2 给药与取血方案

健康家兔6只，实验前禁食12 h，自由饮水，耳缘静脉注射20%氨基甲酸乙酯溶液 （5 mg／kg体质量）麻醉，按10 mg／kg耳缘静脉注射丹参素钠溶液，给药后经颈总动脉取血，收集于肝素化离心管中，4 000 r离心15 min，分离血浆，并于－20℃冷冻保存待测.

2.3 血浆样品预处理

取肝素抗凝血浆100μL，加0.1 mol／L盐酸100μL，1 mol／L盐酸100μL，混匀；加入4 mL醋酸乙酯，涡流混合5 min，离心10 min（3 000 r／min）取上层有机相于另一试管中，40℃水浴氮气吹干，残渣加入10%的甲醇溶液1.0 mL，超声震荡使其溶解，0.45μm微孔有机系膜滤过，4℃冷藏备用.

2.4 血浆样品丹参素的含量测定

2.4.1 方法专属性考察 分别取空白血浆100μL，加生理盐水100μL，按 “血浆样品预处理”项下方法操作，按照所选色谱条件测定.空白血浆加适量丹参素钠对照品溶液，依同法操作，进样测定，考察方法的专属性.结果空白血浆加丹参素的色谱图中5.78 min处有一吸收峰，且与其他色谱峰有较好的分离，见图1，表明空白血浆中的内源性物质不干扰丹参素的测定.

图1 HPLC图谱

2.4.2 标准曲线的制备 精密称取丹参素钠对照品10.0 mg，用生理盐水溶解并定容至50 mL，配制成200μg／mL的对照品溶液.分别取空白血浆100μL，依次加入丹参素钠对照品溶液，配制成含丹参素钠0.1、0.5、1.0、2.0、10、20、50、100μg／mL血浆样品，每个质量浓度3个样本，除不加100μL 0.1 mol／L盐酸外，其他按照 “血浆样品预处理”项下方法操作，进样20μL，记录色谱图.以丹参素峰面积为纵坐标 （Y）和血浆中丹参素的浓度为横坐标 （X），进行线性回归，得到得标准曲线的回归方程：Y＝158.09X－25.77，r＝0.9999，丹参素浓度在0.1～100μg／mL之间呈良好的线性关系.

2.4.3 精密度试验 取空白血浆100μL，分别加入丹参素钠系列对照品溶液，制成含丹参素钠0.1、10、100μg／mL的血浆，按照 “血浆样品预处理”项下方法处理，每种浓度重复进样5次，记录峰面积，计算精密度，见表1，结果表明所选方法符合中药生物活性测定指导原则的要求［5］.

表1 丹参素精密度实验

表2 丹参素稳定性实验

2.4.4 稳定性试验 取空白血浆100μL，分别加入丹参素钠系列对照品溶液，分别制成含丹参素钠0.1、10、100μg／mL的血浆，按照“血浆样品的预处理”项下方法操作，分别在0、1、2、4、6、10、12 h测定，记录色谱峰面积，见表2，结果表明样品稳定性符合测定要求.

2.4.5 回收率试验 取空白血浆100μL，分别加入丹参素钠对照品溶液，配制成含丹参素钠0.1、10、100μg／mL的血浆各3份，置于具塞离心管中，混匀，按 “标准曲线的绘制”项下方法操作，进样测定，记录被测物的峰面积，按测得量和加入量计算方法回收率，平均回收率分别为98.7%、96.8%、101.4%，RSD分别为2.33%、3.01%、2.78%.表明方法回收率符合实验测定要求.

3 讨 论

丹参素为亲脂性药物，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，而血样中含有的大多数内源性干扰物是强极性的水溶性物质.因而本实验采用醋酸乙酯进行液－液萃取，在酸性条件下，游离的丹参素容易被醋酸乙酯提取，且回收率高，重现性好，内源性杂质干扰小.

本实验应用HPLC测定家兔血浆中丹参素的含量，此法具有灵敏度高，专属性强，准确，精密度高等优点.适用于血浆样品的快速大量分析.

［1］ 李艳杰，孙玉华.丹参素药理作用研究进展 ［J］.延边大学医学学报，2006，29（1）：73－75

［2］ 宋金春，唐开勇.通脉口服液的质量标准研究 ［J］.中国药房，2006，17（22）：1 730

［3］ 靳宝峰，张志国，杨松，等.反相高效液相色谱法测定心脉通冻干粉针中丹参素及原儿茶醛 ［J］.药物分析杂志，2002，22 （6）：477

［4］ 游勇基，程广强，陈铭辉.丹参注射液中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛和丹参酸B的含量 ［J］.药物分析杂志，2004，24 （1）：7

［5］ 中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典一部 ［S］.北京：人民卫生出版社.2010：附录132