抑制p38 MAPK活化对脓毒症大鼠肺部及血管组织中i NOS及NO合成的影响

王松柏，翟秀珍，曹怀宇，张艳丽

（1.中国人民解放军第251医院麻醉科，河北 张家口075000；2.河北北方学院附属第一医院神经内科，张家口075000）

脓毒症及脓毒症休克是烧伤、严重创伤和感染性疾病的常见并发症.细胞信号通路与脓毒症关系的研究方兴未艾.研究表明MAPK（mitogen activated protein kinase）信号通路在炎症反应、细胞应激反应、细胞迁移、凋亡等方面起着重要作用［1］.体外实验表明MAPK活化促使诱导型一氧化氮合成酶 （i NOS）及一氧化氮 （NO）合成增加［2］，参与介导脓毒症发生和发展.然而，MAPK通路活化、i NOS和NO表达及脓毒性休克循环障碍三者之间的相互关系尚不清晰.本研究旨在通过抑制p38 MAPK信号通路，探讨MAPK通路对组织中i NOS基因表达和NO含量的影响，并观察其及对循环动力学的影响.

1 材料与方法

1.1 动物模型制作

2月龄的雄性清洁级SD大鼠 （中国医学科学院实验动物繁育场），饲养2周后体质量 （215±24）g，实验前禁食1 d，自由饮水.参照Chaudry报道方法行盲肠结扎穿孔术 （CLP）制造脓毒症模型［3］.方法如下：在SD大鼠腹腔注射质量分数为2%戊巴比妥钠 （80 mg／kg）后固定，铺无菌洞巾.沿腹正中线切口，结扎盲肠根部，用18号针在盲肠上穿刺3次形成盲肠漏，逐层缝合腹壁切口.术毕立即在动物皮下注射林格氏液15 mL抗休克.

1.2 动物分组

64只大鼠随机分成4组：①正常组：8只，麻醉后即刻处死；②假手术组：8只，麻醉后切开腹壁后立即缝合，2 h后处死；③脓毒症组 （CLP组）：24只，分别于CLP后2、6、24 h各处死8只；④治疗组：24只，术前12 h灌胃给予SB203580（Promega公司，美国），分别在CLP后2、6、24 h各处死8只.各组大鼠活杀后立即留取主动脉和肺组织冻存于液氮中；同时抽取动脉血离心收取上清液冻于－20℃冰箱中；一并待测.

1.3 血清和组织NO水平

称取适量血管或肺组织，与磷酸盐缓冲液一起置于匀浆器中冰浴匀浆，离心提取上清液，与血清一并严格按NO测定试剂盒 （北京晶美）说明书操作测定NO含量.

1.4 组织i NOS mRNA测定

取适量肺或血管组织，采用异硫氰酸胍一步提取法提取组织总RNA，参照试剂盒 （Pr o mega美国）说明书半定量法 （RT－PCR）测定总RNA纯度和浓度，逆转录获得并扩增c DNA.大鼠i NOS引物序列（扩增片段450 bp）：5′－TG－GCAGGATGAGAAGCTGAG－3′ （上游），5′－CTGGTCGATGTCAT－GAGC AA－3′（下游）；三磷酸甘油醛脱氢酶 （GAPDH）引物序列 （扩增片段309bp）：5′－TCCCTCAAGATTGTCAGCAA－3′ （上游）；5′－AGATCCA－CAACGGATACATT－3′ （下游），由北京北方生物公司合成.i NOS扩增条件为94℃2 min，57℃1.5 min，72℃3 min，35个循环，72℃延伸15 min.扩增产物经质量分数为2%琼脂糖凝胶电泳后拍照，图像分析处理系统 （Beck man，德国）获取GAPDH与i NOS的积分光密度比值代表mRNA相对表达量.

1.5 平均动脉压 （MAP，mm Hg）、脉搏 （次／min）测定

在大鼠左侧颈总动脉插管连接生物信号电脑采集系统 （Pclab，北京威信斯达）测定大鼠的MAP和脉搏.

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 肺、血管组织和血浆中NO含量的变化

正常大鼠血管和肺、血浆NO含量较少，假手术组与正常组比较差异无显著性.与正常组相比，CLP后NO在2 h即明显增高，6 h达到高峰，24 h仍然处在比较高的水平 （P＜0.05）.与CLP组相比，SB203580处理后，NO水平在2 h和6 h时间点有显著性降低 （P＜0.05），见表1.

2.2 血管、肺组织i NOS mRNA的表达变化

正常大鼠肺和血管表达i NOS mRNA较少，假手术组与正常组相比表达无明显差异；与正常组相比，CLP后大鼠i NOS mRNA表达各时间点均显著升高 （P＜0.05）.SB203580处理后，与CLP组相比，大鼠i NOS mRNA表达在2、6 h两个时间点有显著性降低 （P＜0.05），见表1.

2.3 脉搏和MAP变化

与正常组比较，假手术组MAP和脉搏变化不明显，CLP后大鼠各时间点脉搏显著增快、MAP显著降低.SB203580处理后，与CLP组比较，大鼠脉搏和MAP在2 h和6 h时间点显著好转 （P＜0.05），见表1.

2.4 相关分析

相关分析表明，血管和肺组织NO含量与i NOSmRNA的表达呈显著正相关，相关系数分别是0.75和0.74；血清NO含量与血管及肺组织i NOS mRNA表达亦呈现较强正相关性，相关系数分别是0.69和0.65（P＜0.05）.MAP与肺、血管和血浆NO含量呈显著性负相关，相关系数分别是－0.85、－0.86和－0.90 （P ＜0.05）.

表1 SB203580对脓毒性休克大鼠循环功能和组织NO、i NOS mRNA表达的影响 （n＝8）

表1 SB203580对脓毒性休克大鼠循环功能和组织NO、i NOS mRNA表达的影响 （n＝8）

注：与正常组比较＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与CLP组中同时相点比 较＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，

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3 讨 论

有文献提示，败血症患者的病死率高达33%～40%，脓毒性休克病死率更高［4］，重症监护病房尤为多见，但临床对其缺乏有效治疗手段.脓毒症休克与多种细胞信号通路及其介导的炎症介质密切相关.比较明确的是CLP后大鼠组织和血清i NOS mRNA和NO水平均显著升高，本实验结果与此基本相符，同时还观察到血压严重下降、脉搏剧烈增快，表现为严重休克.血液中的NO的含量明显高于血管和肺组织；中性粒细胞、巨噬细胞、内皮细胞等均可合成i NOS和NO；因此，众多器官和组织合成的NO共同释放入血并促使血液中的NO升高.假手术组与正常组相比各参数均无显著变化，提示感染性腹膜炎为主要影响因素，NO在其中起着重要作用.

革兰阴性菌的脂多糖通过诱导i NOS高表达从而介导多种组织和细胞产生NO，i NOS催生过量NO是脓毒症休克的重要发病机制之一［5］，大量生成的NO将导致血管张力下降、心脏和血管对儿茶酚胺敏感性下降以及心肌收缩力降低等一系列病理改变，并且可能是感染导致休克的最终共同路径.炎症、脓毒症、休克与众多细胞信号通路以及细胞因子关系错综复杂，其中，MAPK信号通路是致病微生物激发机体抗感染免疫力信号传导中的一个关键通路.LPS可通过激活MAPK通路而诱导i NOS的合成增加［6］，同时TNF－α和IFN－γ等与LPS可相互协同增强i NOS的表达.并且感染可激活多种途径诱生大量TNF－α和IFN－γ等促炎症介质从而直接或间接诱生NO.因此，NO的大量合成与多种机制有关，但MAPK途径在其中有着非常重要的作用，而且抑制MAPK的活性可下调细胞i NOS的表达.

SB203580为p38 MAPK的特异性抑制剂，对p38 MAPK有明显抑制作用，进而抑制细胞因子表达.本实验在使用SB203580后，CLP诱导的肺、血管和血清i NOS mRNA表达和NO含量升高的幅度明显减弱，且循环动力学明显好转，相关分析也提示NO含量与血压脉搏具有较强的相关性.提示抑制p38 MAPK活化可抑制脓毒症大鼠的i NOS表达，进而下调NO水平，且可改善休克导致的循环功能不全，循环功能的好转可能与i NOS和NO下调有关.MAPK还可能通过调节其他炎症介质的表达，进而影响循环功能.

但也有研究发现，NO升高可有助于机体杀灭致病微生物.而且实验发现，采用基因敲除的方法产生i NOS缺陷小鼠，结果i NOS缺陷小鼠盲肠结扎穿术后的死亡率明显高于野生型.提示i NOS及其介导生成的NO对动物具有有益的一面.这些不一致的观点说明NO、i NOS的调节过程非常错综复杂，不同实验所采用的实验动物种属、模型等实验背景不同都有可能导致结论迥异.

本实验结果提示p38 MAPK途径与大鼠脓毒症的i NOS和NO诱生密切相关，并且这一作用与脓毒症的循环功能变化密不可分，调控MAPK途径可能将成为治疗脓毒症休克手段之一，其量效和时效关系有待于进一步实验摸索.

［1］ Cancino－Rodezno A，Porta H，Soberon M，et al.Defense and death responses to pore for ming toxins.Biotechol Gen Eng Rev，2009，26：65－94

［2］ Jin BJ，Se CH，Hyung JJ，et al.Anti－inflammatory effect of 2－Methoxy－4－Vinylphenol via the suppression of NF－κB and MAPK activation，and acethlation of histone H3 ［J］.Arch Phar m Res，2011，34 （12）：2109－2116

［3］ Chaudry I H，Wichter man KA，Baue AE.Effect of sepsis on tissue adenine nucleotide levels ［J］.Surgery，1979，85：205－211

［4］ Ku mar A，Haery C，Pamillo J E.Myocardial dysf unction in sep ticshock ［J］.Crit Care Clin，2000，16 （2）：251－287

［5］ Li HY，Yao YM，Shi ZG，et al.Significance of biopterin inductionin rats with postbur n staphylococcus aureus sepsis［J］.Shock，2003，20 （2）：159－165

［6］ Zhan J，Zhang ZZ，Chen CH，et al.Penehyclidine hydrochloride attenuates LPS－induced i NOS production by inhibiting p38 MAPK activation in endothelial cells［J］.Mol Biol Rep，2012，39：1261－1265