CCK-8检测GIK液对肿瘤细胞的生长抑制作用

刘龙燕，孟 伟，刘国燕，邹学森，陈岳青，王春阳

(1、江西省肿瘤医院检验科，江西 南昌330029;2、南昌大学第一附属医院神经外科；3、江西省妇幼保健院)

CCK-8检测GIK液对肿瘤细胞的生长抑制作用

刘龙燕1，孟 伟2，刘国燕3，邹学森1，陈岳青1，王春阳1

(1、江西省肿瘤医院检验科，江西 南昌330029;2、南昌大学第一附属医院神经外科；3、江西省妇幼保健院)

目的研究GIK液的体外抗肿瘤作用。方法采用细胞毒性检测CCK-8法检测GIK液对人宫颈鳞癌细胞株(SiHa)的体外抑制作用。结果GIK液对SiHa的半数抑制浓度IC50为293.30μg/ml。结论不同浓度的GIK液在体外对肿瘤细胞有不同程度的生长抑制作用，且呈浓度依赖关系。

GIK；体外；抗肿瘤

GIK液(glucose-insulin-potassium)俗称极化液是由葡萄糖、胰岛素和氯化钾组成的细胞代谢调节制剂，用于缺血性心脏病辅助治疗已有40多年的历史，其疗效越来越得到肯定[1，2]。作为心血管内科的一种“老药新用”，科学合理配置葡萄糖与胰岛素的比值，不仅不会出现因输入胰岛素引起低血糖，而且还能为机体提供能源物质。近年研究发现，胰岛素受体广泛存在于心脏、肝脏、子宫等器官的组织细胞，外源性胰岛素与其受体结合直接发挥保护器官和组织的作用。此外，国内外最近基础研究表明，过去主要用于降血糖治疗的内源性激素胰岛素，不仅是一种重要的内源性抗炎因子[3]，而且还是一种重要的生长调节因子[4]。

宫颈癌是全球女性中仅次于乳腺癌的常见恶性肿瘤[5]，目前，宫颈癌的治疗手段主要为手术结合放疗、化疗，众所周知，手术创伤大，而放、化疗毒副作用强，在临床治疗中寻求一种既能减轻抗肿瘤治疗的毒副作用又能不干扰其疗效的辅助用药迫在眉睫。GIK作为一种辅助用药在肿瘤治疗中，具有较好的应用前景。本文采用细胞增殖/毒性检测试剂(Cell Counting-Kit8,CCK-8)法对GIK的细胞毒性作用进行了初步研究，为进一步开展GIK的体内抗肿瘤作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 酶标仪购自雷博公司；CO2恒温培养箱购自三洋公司；超净工作台购自苏州净化设备厂；台式离心机购自长沙相仪离心机仪器有限公司；生物显微镜购自OLYMPUS公司；细胞增殖/毒性检测试剂CCK-8购自日本株式会社；肿瘤细胞株(SiHa)由南昌大学医学院药理教研室提供；GIK液配制所需药物均有本单位药房提供；DMEM细胞培养液购自NEURONBC公司；优质胎牛血清购自GIBCO公司。

1.2 试验方法

1.2.1 GIK液配置 参照文献[2]用等渗盐水配制含葡萄糖、胰岛素(武汉生物试剂有限公司)和氯化钾终浓度分别为100g/L、80U/L、5g/L的GIK液。

1.2.2 肿瘤细胞培养 肿瘤细胞用含10%胎牛血清的 DMEM 培养基，于 37℃，5%CO2培养，用 0.25%胰酶-0.02%EDTA消化，传代，收集增殖旺盛、状态良好的细胞，用细胞培养液悬浮后，计数肿瘤细胞，调整肿瘤细胞浓度为200μl，悬液中含有细胞数为4000。

1.2.3 肿瘤细胞悬浮液包被96孔板，每孔200μl，4h后，加入不同浓度的GIK液10μl,药物设有60、120、240、480 和 960μg/ml五个浓度， 每个浓度设有5个平行复孔，细胞培养箱继续培养48h后加入 10μl的 CCK-8试剂，37℃孵育 2h，测定 490nm光密度，同时设以肿瘤细胞和药物为对照。

2 结果

通过测得的光密度值，计算出药物对相应肿瘤细胞的抑制率，抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。 实验结果见表1、表2、图1。

结果可以看出：体外试验中，GIK液对SiHa细胞具有抑制生长的作用，但不同浓度的药物在同一时间对SiHa细胞的抑制作用不尽相同，其中在240μg浓度时对SiHa细胞具有明显的抑制作用，960μg对SiHa的抑制作用达到90%以上。GIK液对SiHa细胞的半数抑制浓度IC50为293.30μg/ml。

表1 GIK液对人宫颈癌细胞生长的影响(n=5,±s)

表1 GIK液对人宫颈癌细胞生长的影响(n=5,±s)

*P<0.001与未加药物的细胞组相比有显著性差异。

未加药60细胞GIK药物浓度(μg/ml)120 240 480 960 48h OD值(490nm) 0.574±0.060 0.536±0.053 0.514±0.064 0.329±0.026* 0.099±0.015* 0.062±0.017*

表2 GIK液对人宫颈癌细胞抑制率的影响（n=5,±s）

表2 GIK液对人宫颈癌细胞抑制率的影响（n=5,±s）

*P<0.001与未加药物的细胞组相比有显著性差异

60 120 240 480 960 IC50(μg/ml)抑制百分率（%） 6.8±1.77 10.5±1.32 43.2±1.961* 82.8±1.632* 90.8±0.582* 293.30±21 GIK药物浓度(μg/ml)

图1 GIK液对人宫颈癌细胞抑制率的影响

3 讨论

肿瘤的发生、发展与细胞凋亡的抑制以及细胞增殖和分化异常密切相关。研究进展表明：肿瘤共性的生物学特征是失控性生长，可以说肿瘤是细胞失控性生长所致的一类细胞周期性疾病。肿瘤细胞的特征之一是异常增殖，目前的抗肿瘤药物都是以抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗肿瘤的目的，但因为肿瘤是全身的疾病，抗肿瘤药物在治疗的同时大都伴有一定程度的副作用如：脱发、恶心、呕吐等，让病人苦不堪言。在临床化疗辅助用药的目的是为了减轻病人使用抗肿瘤药物时的反应，使抗肿瘤药物最大限度的发挥其抗肿瘤的效果。但是化疗辅助用药的治疗成本较高，让大多数患者难以承受。

作为一种辅助用药GIK液使用安全，治疗成本低，国内外目前对GIK液的研究主要是在心血管和创伤领域[6,7]，在肿瘤领域应用目前还是一片空白，鉴于胰岛素受体广泛存在于人体各个器官的特点，本文作者大胆提出其对肿瘤细胞也具有抑制作用，本文实验了解其在体外对肿瘤细胞的抑制杀灭作用，计算了IC50值，初步显示GIK液对肿瘤细胞的体外抑制作用，GIK液对机体免疫功能、血液流变以及肿瘤细胞凋亡的影响有待进一步研究。

本文采用CCK-8法检测细胞增殖，与常用的MTT法相比，无需有机溶剂，步骤少，操作简单，无损失，结果准确，是一种更加方便的细胞毒性/增殖检测方法。

[1]Rojas Perez EM,Luna Ortiz P,Serrano Valdez X,et al.Glucoseinsulin-potassium(GIK)solution:Cardioprotective effects of insulin[J].Arch Cardiol Mex.2006,76 Suppl 4:S144-151.

[2]钱学贤.极化液、胰岛素保护缺血/再灌注的新机制―又一个老药新观点的典范[J].中华内科杂志,2003,42:145-147

[3]Quinn DW,Pagano D,Bonser RS,et al.Glucose and insulin influences on heart and brain in cardiac surgery[J].J Semin Cardiothorac Vasc Anesth,2005,9(2):173-178.

[4]Liu Y,Zhang X,Zhang Z,et al.The influence of topical application of insulin on the formation of basement membrane in scalded rats[J].Zhong Hua Shao Shang Za Zhi,2005,21(6):445-447.

[5]Parkin DM,Bray FI,Devesa SS.Cancer burden in the year 2000.The global picture[J].Eur J Cancer,2001,37 Suppl 8:S4-66

[6]Li J,Wu F,Zhang H,et al.Insulin inhibits leukocyteendothelium adherence via an Akt-NO-dependent mechanism in myocardial ischemia/reperfusion[J].Mol Cell Cardiol,2009,47:512-519.

[7]Wang Z,Liu L,Hu T,et al.Protective effect of glucose-insulinpotassium (GIK)on intestinal tissues after severe burn in experimental rats[J].Burns,2012,38(6):846-854.

Detecting the tumor cell growth inhibiting activity of GIK liquid using cell counting-kit 8.

LIU Longyan，MENG Wei,LIU Guoyan,et al.Laboratory Department， Tumor Hospital of Jiangxi Province,Nanchang 330029,China

ObjectiveTo study the anti-tumor effects of glucose-insulin-potassium (GIK)solution.MethodsCCK-8 assay was used to detect the cell growth inhibiting activity of GIK on human cervical squamous cell carcinoma cell line (SiHa).ResultsThe half inhibitory concentration (IC50)of GIK to SiHa cells is 293.30μg/ml.ConclusionDifferent concentrations of GIK solution in vitro have different growth inhibiting effects on tumor cells,and this is does-dependent.

GIK；In vitro；Anti-tumor

R73-35+1,R737.33,R73-36+2

A

1674-1129(2012)05-0430-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.05.004

江西省卫生厅课题(编号：20081279)

刘龙燕，女，1978年12月出生，毕业于南昌大学医学院，医学硕士，研究方向：GIK液在妇科肿瘤治疗中的辅助作用。通信作者：邹学森tom445x@126.com