大蒜素对慢性铁中毒大鼠氧化应激与肝细胞自噬的抑制作用

刘重斌，王瑞，董缪武，吴博，肖敏

(1.湖州师范学院医学院生理与药理学教研室，浙江湖州313000;2.温州医学院实验动物中心，浙江温州325035)

大蒜素对慢性铁中毒大鼠氧化应激与肝细胞自噬的抑制作用

刘重斌1，王瑞1，董缪武2，吴博2，肖敏2

(1.湖州师范学院医学院生理与药理学教研室，浙江湖州313000;2.温州医学院实验动物中心，浙江温州325035)

目的探讨大蒜素(allicin)对慢性铁中毒大鼠氧化应激与肝细胞自噬的抑制作用及可能机制。方法36只SD大鼠按体质量随机分为6组，即正常对照(饲喂基础饲料)、慢性铁中毒模型(饲喂高铁饲料)、正常+大蒜素40 mg·kg-1、慢性铁中毒+大蒜素30，40和60 mg·kg-1组，每组6只。持续饲喂6周后，取血及肝、结肠和肾组织用试剂盒测定铁含量、总铁结合力、丙二醛(MDA)含量及总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性。透射电镜和免疫组织化学方法观察肝细胞形态结构、自噬以及胱天蛋白酶3凋亡蛋白、Ki-67细胞增殖抗原和LC3-B微管相关蛋白表达的变化。结果与正常对照组比较，模型组血清铁含量增加(P＜0.01)，总铁结合力下降(P＜0.01)，肝和结肠组织铁含量增加(P＜0.05)。与模型组比较，饲喂不同剂量大蒜素大鼠血清铁含量显著下降(P＜0.05)，总铁结合力显著增加(P＜0.05)，结肠组织铁含量显著下降(P＜0.05);饲喂大蒜素40和60 mg·kg-1肝组织铁含量显著下降(P＜0.05)。与正常对照组比较，模型组肝和结肠组织MDA含量显著增加(P＜0.05)，肝组织T-SOD活性增加(P＜0.01)，结肠组织T-SOD活性下降(P＜0.01)。与模型组比较，饲喂大蒜素组肝组织MDA含量显著下降(P＜0.05)，结肠和肾组织T-SOD活性显著增加(P＜0.05)。与正常对照组比较，模型组肝实质细胞和肝非实质细胞Ki-67增殖抗原表达显著增加(P＜0.05)，胱天蛋白酶3凋亡蛋白表达无明显变化(P＞0.05)。观察肝细胞超微结构，模型组大鼠肝细胞有大量铁蛋白颗粒累积，线粒体和内质网膜膨胀，胞质中形成自噬前体。模型组大鼠肝细胞LC3-B微管相关蛋白有较强表达，正常对照和正常+大蒜素组肝细胞未发现LC3-B免疫阳性染色。结论大蒜素能有效清除体内自由基，增强机体抗氧化能力，降低肝中铁诱导的氧化压力、线粒体膜的改变和细胞自噬，对慢性铁中毒肝细胞具有一定的保护作用。

大蒜素;铁中毒;氧化应激;自噬

铁是机体最多的微量元素，在能量代谢、细胞增殖和DNA修复中起重要作用［1-3］。而机体过多的自由铁却通过催化Fenton反应生成具有高度反应活性的羟自由基，导致氧化应激，从而损害机体的一些基本成分，如脂质、蛋白质和DNA等，最终导致细胞损伤和凋亡［4-5］。大蒜素(allicin)是从药用植物大蒜(Allium sativum L.)的球形鳞茎中提取的一种有机硫化合物(diallyldisulfid-S-oxide)，也存在于洋葱和其他葱科植物中。研究表明，大蒜素具有抗菌、消炎、抗氧化、抗血栓、降血压、维持脂蛋白平衡和防治动脉硬化等功效［6-8］。但目前关于大蒜素对机体铁代谢的作用及其对慢性铁中毒大鼠氧化应激与细胞自噬保护作用的相关文献报道甚少。本研究通过制备慢性铁中毒SD大鼠模型，同时饲喂不同剂量的大蒜素，探讨大蒜素对慢性铁中毒大鼠氧化应激与细胞自噬的保护作用及可能机制，为慢性铁中毒相关疾病的日常营养和药理研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、主要试剂和仪器

雄性SD大鼠36只，体质量196～220 g，由温州医学院实验动物中心提供，动物使用许可证:浙22-005234。大蒜素软胶囊购自美国Herbalife公司，实验前用色拉油配制。鼠抗人胱天蛋白酶3凋亡蛋白单克隆抗体和兔抗人LC3-B微管相关蛋白多克隆抗体:碧云天生物技术有限公司;鼠抗人Ki-67细胞增殖抗原蛋白单克隆抗体、免疫组化SP法试剂盒和免疫组化二步法试剂盒:北京中杉金桥生物技术有限公司;丙二醛(malondialdehyde，MDA)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、考马斯亮蓝蛋白、血清铁和总铁结合力(total iron-binding capacity，TIBC)测定试剂盒:南京建成生物工程研究所;硫酸亚铁(FeSO4·7H2O):福建莆田市高屿贸易有限公司;其余试剂均为市售分析纯。722型分光光度计:上海分析仪器厂;酶标仪:荷兰帕纳科公司;H-7500型透射电镜:日本日立公司。

1.2 动物分组和给药

大鼠按体质量随机分为正常对照(饲喂基础饲料，铁含量为50 mg·kg-1)、慢性铁中毒模型(饲喂高铁饲料，铁含量为1000 mg·kg-1)、正常+大蒜素40 mg·kg-1、慢性铁中毒+大蒜素30，40和60 mg·kg-1共6组，每组6只。ig给予含大蒜素的色拉油，每天1次［4］。饲料饲喂前按要求进行消毒处理，铁含量采用原子吸收光谱法进行测定。饲料中其他金属元素含量保持正常不变。各组大鼠分笼饲养，温度24～26℃，光照明12 h/暗12 h。大鼠自由饮食和饮水，饲喂处理持续6周。

1.3 样品制备

实验结束后，各组大鼠经10%水合氯醛麻醉，于腹主动脉取血，1200×g离心10 min，取上清-20℃保存备用。同时，迅速取肝、结肠和肾，分别称重后-80℃保存备用。测定前制备各组织匀浆，稀释成10%匀浆液，1200×g离心10 min，取上清，根据不同指标稀释成最佳浓度待测。

1.4 血清铁、总铁结合力及氧化应激指标MDA和T-SOD测定

血清铁和总铁结合力及肝、结肠和肾组织铁含量严格按照各试剂盒的方法测定并计算。氧化应激指标MDA和T-SOD的测定，严格按照考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒说明书用酶标仪在595 nm处测定各组织中蛋白含量，分别用酶标仪于532和550 nm处测定吸光度(A)值。

1.5 免疫组织化学染色

取肝组织4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋。切片复水后，经热抗原修复和消除内源性过氧化物酶之后，分别滴加鼠抗人胱天蛋白酶3单克隆抗体(1∶50)和兔抗人LC3-B多克隆抗体(1∶200)，4℃孵育过夜后，分别按照二步法试剂盒说明书方法进行二抗孵育，DAB显色，苏木素复染、脱水、透明、封片至显微摄影。免疫组化常规SP法检测肝组织Ki-67细胞增殖抗原表达(抗体1∶1000稀释)。每组中每只大鼠胱天蛋白酶3和Ki-67阳性细胞在100倍视野下计数(棕褐色染色细胞为阳性细胞)，分别计算凋亡细胞和增殖细胞数(用每平方毫米标记的细胞数计算)。

1.6 肝细胞超微结构观察

各组大鼠麻醉后，迅速取肝组织经2.5%戊二醛和1%锇酸固定后，脱水、包埋、固化、超薄切片和染色后在透射电镜下观察并拍片。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 大蒜素对慢性铁中毒大鼠血清和组织铁含量的影响

由表1看出，与正常对照组比较，模型组大鼠血清铁含量显著增加(P＜0.01)，总铁结合力显著下降(P＜0.01)，肝和结肠组织铁含量显著增加(P＜0.05)，而肾组织铁含量无明显变化。与模型组比较，模型+大蒜素各组大鼠血清铁含量显著下降(P＜0.05，P＜0.01)，总铁结合力显著增加(P＜0.05，P＜0.01);除肾组织外，各组大鼠肝和结肠组织铁含量也显著下降(P＜0.05)。

Tab.1 Effect of allicin on iron status of serum and tissues in iron-overloaded rats

2.2 大蒜素对慢性铁中毒大鼠氧化应激的影响

由表2可见，与正常对照组比较，模型组大鼠肝组织MDA含量显著增加(P＜0.05)，结肠组织MDA含量显著增加(P＜0.01)，而肾组织MDA含量无明显变化(P＞0.05);正常+大蒜素组大鼠肝组织MDA含量下降(P＜0.05)。与模型组比较，模型+大蒜素各组大鼠肝组织MDA含量显著下降(P＜0.05)，除模型+大蒜素40 mg·kg-1组大鼠结肠组织MDA含量显著下降(P＜0.05)，其他各组结肠和肾组织MDA含量均无明显变化。与正常对照组比较，模型组和正常+大蒜素组肝组织T-SOD活性增加显著(P＜0.01)，肾组织T-SOD活性无明显变化;与模型组比较，模型+大蒜素各组大鼠结肠和肾组织T-SOD活性显著增加(P＜0.05)，肝组织T-SOD活性无明显变化。

2.3 大蒜素对慢性铁中毒大鼠肝细胞增殖和凋亡的影响

胱天蛋白酶3免疫阳性反应并统计结果(图1，表3)显示，各组大鼠肝细胞凋亡数目无明显变化。Ki-67免疫阳性反应并统计结果(图2，表3)显示，模型组与正常对照组比较，慢性铁中毒显著增加了肝细胞和肝非实质细胞增殖(P＜0.05)，而且增殖的细胞主要是肝非实质细胞;与模型组相比，模型+大蒜素40 mg·kg-1组肝细胞增殖无明显变化，肝非实质细胞增殖显著降低(P＜0.05);模型+大蒜素40 mg·kg-1组肝细胞和肝非实质细胞增殖数量与正常对照组比较明显增加。

Tab.2 Effect of allicin on malonedialdehyde(MDA)content and total superoxide dismutase(T-SOD)activity in liver，colon and kidney tissue of iron-overloaded rats

Fig.1 Effect of allicin on hepatocyte apoptosis in liver tissue of iron-overloaded rats(Immunostaining×400).See Tab.1 for rat treatments.A:normal;B:iron model;C:normal+allicin 40 mg·kg-1;D:model+allicin 40 mg·kg-1.→:caspase 3 positive cells.

Fig.2 Effect of allicin on hepatocyte proliferation in liver tissue of iron-overloaded rats(Immunostaining×400).See Tab.1 for rat treatments.Ki-67 cell proliferation antigen immune reaction positive cells were detected by SP reagent kit.A:normal;B:iron model;C:normal+allicin 40 mg·kg-1;D:iron+allicin 40 mg·kg-1.↓:hepatocytes;→:non-parenchymal cells.

Tab.3 Effect of allicin on number of apoptotic cells and proliferation cells in hepatocytes and in non-parenchymal cells of iron-overloaded rats

2.4 大蒜素对慢性铁中毒大鼠肝细胞超微结构的影响

肝细胞透射电镜结果显示，与正常对照组(图3A)比较，正常+大蒜素40 mg·kg-1组可见胞质中累积了大量的脂滴(图3B)。模型组大鼠肝细胞胞浆内出现了大量的电子致密颗粒，这些铁蛋白分子颗粒大多集中在胆小管附近及细胞连接处(图3C);同时可见线粒体和内质网膨胀，胞膜发泡并出现内陷(图3D)。模型+大蒜素40 mg·kg-1组细胞质中未见大量的电子致密颗粒，线粒体和内质肉结构与正常对照组相似(图3E)。

2.5 大蒜素对慢性铁中毒大鼠肝细胞自噬的影响

Fig.3 Effect of allicin on ultrastructural changes in liver of iron-overloaded rats.See Tab.1 for rat treatments.A:normal;B:normal+allicin 40 mg·kg-1;C and D:iron model;E:iron+allicin 40 mg·kg-1.↑:iron-rich ferritin localized in the lumen and near the bile canaliculus along with lysosome;M:mitochondria.

肝细胞透射电镜结果显示，与正常对照组(图4A)比较，模型组肝细胞胞质中先形成自噬前体，多呈新月形或半环形，随着自噬前体不断延长和增大曲度，内腔明显变窄(图4B)，这些自噬前体伴随溶酶体和富含铁的铁蛋白分子，最终与溶酶体融合，内容物被溶酶体酶降解(图4C);正常+大蒜素40 mg·kg-1组(图4D)胞质中虽然累积了大量的脂滴，未见肝细胞自噬;模型+大蒜素组(图4E)肝细胞结构与与正常对照组相似，亦未见肝细胞自噬。LC3-B能识别微管相关蛋白亲链，并与自噬小体膜特异性结合。免疫组化实验结果表明，模型组肝细胞有较强的LC3-B免疫阳性反应，且免疫阳性细胞主要集中在门脉区(图5B);而模型+大蒜素40 mg·kg-1组肝细胞中LC3-B免疫阳性染色明显减弱(图5D);正常对照组(图5A)和正常+大蒜素40 mg·kg-1组未检测到LC3-B免疫阳性反应(图5C)。

Fig.4 Effect of allicin on hepatocyte autophagy in liver of iron-overloaded rats.See Tab.1 for rat treatments.A:normal;B and C:iron model;D:normal+allicin 40 mg·kg-1;E:iron+allicin 40 mg·kg-1.→:autophagic vacuoles with different shapes and stages containing iron-rich ferritin molecules.↑:iron-rich ferritin.

Fig.5 Effect of allicin on expression of LC3-B microtubule related protein in hepatocytes of iron-overloaded rats(Immunostaining).See Tab.1 for rat treatments.A:normal;B:iron model;C:normal+allicin 40 mg·kg-1;D:model+allicin 40 mg·kg-1.

3 讨论

大蒜素为百合科植物大蒜鳞茎中所含的一种生物活性成分，具有清除自由基、预防心脑血管疾病、抗衰老和抗感染等多种药理作用，尤其是对于防治心血管损伤的相关机制已有较多报道［9-11］。元素铁由于其独特的化学反应活性，在维持细胞和机体正常代谢过程中起着至关重要的作用。机体多种疾病如帕金森病、阿尔茨海默病、铁源性心脏病和慢性肝纤维化等的发生与铁负荷有关［12-14］。肝是机体铁超载的主要累积器官，铁以Fe3+形式存在于铁蛋白分子中，散在于细胞胞浆中或定位在溶酶体附近［12］。本研究结果显示，模型组大鼠肝组织中不仅蓄积了大量的致密铁颗粒，而且在超微结构上出现线粒体和内质网膜的改变和肿胀，从而改变了线粒体膜的流动性和DNA的完整性。过量铁还通过降低细胞色素氧化酶C的活性，减弱了线粒体的呼吸作用，引起肝细胞的损伤和死亡。正常大鼠给予大蒜素，肝组织中积累了大量的脂滴，模型+大蒜素40 mg·kg-1大鼠肝组织电子致密的铁蛋白储存减少，线粒体膜结构完整。

模型组大鼠血清、肝和结肠组织中铁含量显著增加，血清中TIBC明显下降，可能是因为血清中铁含量超过了铁蛋白结合力时，聚集的铁则以非铁蛋白结合形式存在，这样更易活化ROS并引起细胞损伤和死亡［15］。模型组大鼠肝和结肠组织中MDA含量显著增加，脂质过氧化严重，而模型+大蒜素大鼠通过减少血清和组织中铁含量和增加铁蛋白结合力，从而减少铁引起的细胞损伤。本研究结果还显示，慢性铁中毒显著增强了肝T-SOD活性，而结肠组织T-SOD活性显著下降，这是由于机体氧化应激作用较弱时，组织中将过量表达SOD，以提高机体抗氧化系统能力，清除羟基，降低过氧化压力，减少铁负荷引起的大量毒性的活性氧。但在结肠组织中由于铁含量的升高，持续产生大量的毒性ROS，T-SOD活性反而下降。本研究结果表明，大蒜素能稳定细胞膜结构，具有抗氧化作用，减轻脂质过氧化对组织细胞的损伤。这可能是因为在脂质过氧化反应中抗氧化剂的阻断，不能发生自由基连锁反应，使生物膜磷脂中的不饱和脂肪酸未受到氧化，不能生成过氧化脂质。

肝组织免疫组化研究结果显示，慢性铁中毒不会引起细胞凋亡但会引起细胞增殖，表明这两者之间是不平衡的。其中铁诱导细胞的增殖主要为肝非实质细胞，这可能是由于铁沉积在肝非实质细胞内，导致了这些细胞明显增殖。而模型+大蒜素40 mg·kg-1组大鼠通过降低肝脏中铁的累积，从而降低了铁介导的细胞增殖。有研究表明，肝细胞增殖与肝细胞中D1蛋白的水平有关［14］。

自噬主要的生理功能是将胞质中的大分子物质如蛋白质、RNA和过量储存的糖原等和一些细胞内源性底物(包括由于生理或病理原因引起的衰老、破损的细胞器)在单位膜包裹的囊泡中大量降解，实现再循环，以维持细胞自身的稳定［16-17］。自噬是细胞对持续性内外刺激的非损伤性应答反应，以维持细胞结构、代谢和功能的平衡。Kabeya等［18］报道，LC3-Ⅱ(B)在自噬体和自噬前体的内外膜特异表达，表明微管参与自噬前体的组装和自噬体的运输。LC3为微管相关蛋白1和轻链3，是酵母Atg8的同源体。LC3包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，前者是可溶性的，后者结合于自噬结构膜上。LC3-B的表达与自噬结构形成成正比。自噬既可以作为一种防御机制清除胞质内受损的细胞器和代谢产物，进行亚水平上的重构，保护受损的细胞，同时它作为一种细胞死亡程序诱导细胞主动性死亡。本研究结果显示，正常对照组、正常+大蒜素组、模型+大蒜素40 mg·kg-1组很少检测到自噬小体的存在，而模型组肝出现了形态改变伴随细胞的增殖和自噬小体的增加。溶酶体在自噬中起重要作用，溶酶体与自噬小体相融合形成自噬溶酶体，在自噬溶酶体中大量的细胞器和蛋白质被酸性水解酶所降解。本研究结果显示，电子致密的细胞液包涵体，也就是含有铁沉淀物的溶酶体，在自噬小体附近或被其包围。自噬大分子包含有铁(铁蛋白和线粒体)。因此，溶酶体膜是否发生过氧化，取决于铁诱导的氧化压力。

自噬能提供一个早期的适应机制从而避免细胞凋亡。大蒜素可阻止肝和结肠中铁诱导的氧化压力和铁诱导的线粒体膜的改变以及肝细胞的自噬，这可能是由于其自由基清除能力和抗氧化能力，而溶酶体主要存在于胆小管附近，表明这可能是铁移出细胞的一个过程。

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Protective effect of allicin against oxidative stress and hepatocyte autophagy in iron-overloaded rats

LIU Chong-bin1，WANG Rui1，DONG Miao-wu2，WU Bo2，XIAO Min2
(1.Department of Physiology and Pharmacology，School of Medicine，Huzhou Normal College，Huzhou313000，China;2.Center of Animals，Wenzhou Medical College，Wenzhou325035，China)

OBJECTIVETo determine the inhibitory effect of allicin on oxidative stress，and hepatocyte autophagy and defence mechanisms.METHODSThirty-six SD rats were randomly divided into normal(basal diet，Fe 50 mg·kg-1)，iron model(high iron diet，Fe 1000 mg·kg-1)，normal+allicin 40 mg·kg-1(basal diet，ig given allicin)，iron model+allicin 30，40 and 60 mg·kg-1(high iron diet，ig given allicin)groups.These rats were fed for 6 weeks.Serum and tissue(the liver，colon and kidneys)iron concentrations，total iron-binding capacity(TIBC)，the level of malondialdehyde(MDA)and total superoxide dismutase(T-SOD)were quantified by reagent kit method.At the same time，the morphological changes of the liver，hepatocyte autophagy and caspase 3，Ki-67 and LC3-B protein expression were evaluated through ultrastructural observation and immunohistochemistry.RESULTSCompared with normal group，the serum iron concentration，TIBC and the liver and colon iron concentrations increased significantly in the iron model group(P＜0.05，P＜0.01).Compared with the iron model group，serum and colon iron concentrations decreased(P＜0.05)and TIBC increased(P＜0.05)in iron model+allicin groups;liver iron concentrations decreased significantly(P＜0.05)in iron model+allicin 40 and 60 mg·kg-1groups.Compared with normal group，the level of MDA in liver and colon and T-SOD activities in the liver increased(P＜0.05，P＜0.01)while T-SOD activities in the colon decreased significantly(P＜0.01).Compared with iron model group，the level of MDA in the liver decreased significantly(P＜0.05)while T-SOD activities in the colon and kidneys increased significantly(P＜0.05).Compared with normal group，cell proliferation increased significantly in hepatocytes and in non-parenchymal cells induced by iron supplementation in the iron model group(P＜0.05)，but caspase 3 immunostaining had no significant difference between these groups.In addition，iron was accumulated within the hepatic lysosomes where it triggered autophagy as evidenced by the formation of autophagic vesicles in the iron model group.It also induced morphologic alterations of the mitochondrial and endocytoplasmic reticulum membranes.In addition，LC3-B was strongly expressed in the iron model group，but was not expressed or attenuated in the normal and normal+allicin groups.CONCLUSIONAllicin can scavenge free radicals efficiently，enhance antioxidant properties，depress the iron-induced oxidation pressure and morphologic alterations of the mitochondrial membranes and cell autophagy.Allicin has potent protection effect on hepatocytes in chronic iron intoxication.

allicin;iron overload;oxidative stress;autophagy

The project supported by Natural Science Foundation of Zhejiang Province(Y2110388);Technological Research Program of Zhejiang Province(2009F80004);Technological Research Program of Zhejiang Province(2011C37091);and Technological Research Program of Wenzhou City(Y20100330)

XIAO Min，E-mail:xiaomin@sina.com

R151.1，R285.5

A

1000-3002(2012)04-0515-007

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.04.009

浙江省自然科学基金(Y2110388);浙江省科技厅项目(2009F80004);浙江省科技厅项目(2011C37091);温州市科技项目(Y20100330)

刘重斌(1972-)，副教授，博士，主要从事营养生理学研究。

肖敏，E-mail:wzxiaomin@sina.com

2012-01-15接受日期:2012-05-16)

(本文编辑:齐春会)