NTHi肺炎小鼠肺2型与3型脱碘酶m RNA的变化

天津市儿童医院内分泌科（天津300074） 商跃云 黄 乐 孙桂香 吕 玲 赵 彦

NTHi肺炎小鼠肺2型与3型脱碘酶m RNA的变化

天津市儿童医院内分泌科（天津300074） 商跃云 黄 乐 孙桂香 吕 玲 赵 彦

目的：探讨不可分型流感嗜血杆菌（NTHi）肺炎小鼠血三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）、促甲状腺素（TSH）及肺2型脱碘酶（D2）与3型脱碘酶（D3）m RNA水平的变化，推测肺炎并正常甲状腺病态综合征（ESS）的发生机制，为其治疗提供理论依据。方法：C57BL／6小鼠随机分为对照组、感染3d组、感染7d组与感染10d组。对照组取血及肺组织，感染组于制备小鼠NTHi肺炎模型后3、7及10d取血及肺组织，放射免疫分析法检测血清T3、T4及TSH水平，实时定量聚合酶链反应（Real－time PCR）法测定肺D2及D3m RNA水平。数据以SPSS13.0统计软件进行统计分析。结果：四组T3、TSH、D2及D3m RNA相对表达水平的差异有统计学意义，T4的差异无统计学意义。感染后3d T3与TSH水平低于对照组，后逐渐回升，于感染后10d其水平与对照组差异无统计学意义；与之相对应，感染后3d D3水平高于对照组，感染后7d D2水平方始高于对照组，后逐渐回落，于感染后10d仍均高于对照组，差异有统计学意义。结论：NTHi肺炎可并发ESS，D2与D3m RNA水平的变化与其发生有关。

流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae，Hi）分为荚膜型和无荚膜型，前者根据荚膜多糖的血清型又分为六种亚型；后者因不能与Hi荚膜多糖抗血清发生凝集反应，称为不可分型流感嗜血杆菌（Nontypeable ha－ernophilus influenzae，NTHi）。无论发达或发展中国家，NTHi相关呼吸道感染仍是儿童呼吸系统疾病的主要原因，主要引起肺炎、会厌炎和中耳炎等［1］。严重的呼吸道感染多伴有正常甲状腺病态综合征［2］（Eu－thyroid sick syndromes，ESS），即甲状腺功能异常，且能排除原发性甲状腺疾病所致改变的一组综合征，其主要表现为血清三碘甲状腺原氨酸（Triiodothyronine，T3）水平降低并伴有反三碘甲状腺原氨酸（Reverse triiodothyronine，r T3）升高。其发生机制尚未完全明了，推测与脱碘酶的改变有关。脱碘酶催化甲状腺激素（Thyroid hormone，TH）在体内的脱碘代谢，是调节TH内稳态的重要因素。脱碘酶共有3种类型，即1型脱碘酶（Type 1 iodothyronine deiodinase，D1）、2 型脱碘酶（Type 2 iodothyronine deiodinase，D2）与3型脱碘酶（Type 3 iodothyronine deiodinase，D3），其中，D1与D2催化外周组织中的甲状腺素（Thyroxine，T4）转化为T3，即甲状腺激素原的活化，而D3的主要作用是清除血清T3和产生r T3，即TH的灭活［3］。本研究旨在通过C57BL／6小鼠NTHi肺炎肺脱碘酶m RNA的变化推测肺炎并发ESS的发生机制，为肺炎并ESS的治疗提供理论依据。

材料与方法

1 实验材料

1.1 主要实验仪器：二氧化碳孵箱：Thermo－Forma SeriesⅡ Water Jackcted CO2Incubator，Thermo Electron Corporation，Finland；紫外分光光度计：Smart Spec TM plus spectrophotometer，Bio－Rad，USA；电泳仪：Power Pac Basic，Bio－Rad，USA；凝胶成像系统：Chemi Doc XRS，Bio－Rad USA；Realtime PCR仪7500型：Applied Biosystems，USA。

1.2 主要试剂：T3、T4及TSH试剂盒：天津九鼎医 学 生 物 公 司 （批 号：160445）；Trizol：Invitrogen Technoloyies Ins，USA（批号：1158824）；DEPC：天津鼎天生物技术有限公司，Sigma分装进口（批号：D5758）；乙二胺四乙酸（EDTA）：Sigma公司（批号：083K5420）；d NTP：Fermentas（批号：9001）；Taq酶：Fermentas（批号：1005）；Oligo d（T）18：大连宝生物工程有限公司（批号：CT201C）；Ribonuclease inhibitor：大连宝生物工程有限公司（批号：CCA3901A）；DL2000 DNA Marker：大连宝生物工程有限公司（批号：CC1502）；逆转录酶 M－MLV：Promega（批号：19847105）；引物合成：北京奥科生物工程公司；Fast－Start Universal SYBR Green Master（Rox）：Roche，Germany（批号：04 913 914 001）。

2 实验方法

2.1 NTHi琼脂珠悬液的制备：将－70℃脱脂牛奶冻存菌株（ATCC 49247，肺炎患者痰标本中分离）划线接种于哥伦比亚巧克力平板，37℃5%CO2培养24～48h，复苏后转种平板，分离出单个菌落。挑取平板4～5个典型菌落种入sBHI肉汤中，悬摇状态下培养18～24h，离心收集细菌，感染缓冲液重悬，倍比稀释，分光光度计测定吸光度，同时进行细菌计数，绘制细菌浓度标准曲线。从新鲜平板挑取菌落，接种于1 000ml sBHI液体培养基中，于37℃悬摇状态下培养18～24h。离心收集细菌，于2×感染缓冲液中重悬，浓缩菌液，调整至细菌浓度2×109～6×109菌落形成单位（Colony－forming unit，CFU）／ml。

细菌浓缩液加热至45℃，取浓缩菌液2ml与45℃溶化的琼脂等量混合，45℃水浴中彻底混匀。5ml注射器吸取混合物3ml迅速注入27ml 4℃快速搅拌着的1×感染缓冲液中，形成由琼脂包裹细菌的NTHi琼脂珠悬液。悬浮液包含细菌浓度为1×108CFU／ml的不定形琼脂珠。吸取30μl于0.lml注射器中，37℃保存备用。

2.2 C57BL／6小鼠NTHi肺炎模型的建立与分组：取5～6周SPF级雌性C57BL／6小鼠32只，体重15～20g（购自军事医学科学院），随机分为对照组、感染3d组、感染7d组与感染10d组，每组8只，乙醚麻醉小鼠，对照组鼻腔吸入30μl空白琼脂珠，感染组鼻腔吸入30μl 1×108CFU／ml的NTHi琼脂珠，诱发肺部炎症，在吸入后3、7及10d取血并处死，取肺组织备用。

2.3 T3、T4、TSH及D2D3mRNA水平的测定：血清T3、T4及TSH水平的定量测定采用放射免疫分析法。D2及D3mRNA水平的定量测定采用实时定量聚合酶链反应（Real time polymerase chain reaction，Realtime PCR）法，主要操作步骤如下：采用Trizol法分别提取肺组织总RNA，紫外分光光度法对其定量，吸光度260／280比值判定纯度，琼脂糖凝胶凝胶电泳检测完整性。经逆转录合成cDNA后进行PCR扩增。内参照肌动蛋白（β－actin）与目的片段D2及D3的引物应用软件Gene Runner、并根据Gen Bank所发布的目的基因序列自行设计，同时经NCBI BLAST检索无显著同源性。具体引物序列和扩增片段长度，见表1。

表1 Real－time PCR 引物序列

Real－time PCR反应体系参照SYBR Green Real time PCR Master Mix试剂盒说明书。PCR循环参数：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸34s，进行40个循环。温度变化速度为3℃／s，在每个循环延伸阶段检测荧光信号，进行实时监控，最后进入解链阶段，绘制产物的融解曲线，以了解样品扩增的特异性，保证测定结果的准确可靠。数据的收集由ABI 7500定量PCR仪自带软件完成。每管样品重复测定4次。

3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较用单因素方差分析，进一步比较采用Dunnet检验。

结 果

T3、T4、TSH及D2D3m RNA水平比较：四组T3、TSH、D2及D3m RNA相对表达水平的差异有统计学意义（F＝47.129、9.028、16.600、10.505，P＜0.01），T4的差异无统计学意义（F＝0.467，P＞0.05）。感染后3d T3与TSH水平低于对照组，后逐渐回升，于感染后10d其水平与对照组差异无统计学意义；与之相对应，感染后3d D3水平高于对照组，感染后7d D2水平方始高于对照组，后逐渐回落，于感染后10d其水平仍均高于对照组，差异有统计学意义，见附表。

附表 T3、T4、TSH及D2 D3 m RNA水平比较（±s，n＝8）

附表 T3、T4、TSH及D2 D3 m RNA水平比较（±s，n＝8）

注：与对照组比较＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

m RNA对照组 1.04±0.10 116.38±22.32 3.23±0.21 1.00±0.00 1.00±0.00组别 T3（μg／L） T4（μg／L） TSH（Iu／L） D2 m RNA D3 3d 0.60±0.10＊＊ 112.46±24.49 2.89±0.10＊＊ 1.01±0.11 1.59±0.34＊＊7d 0.62±0.09＊＊ 112.10±28.16 2.91±0.23＊ 1.31±0.13＊＊ 1.77±0.45＊＊10d 0.93±0.06 102.23±24.50 3.29±0.23 1.30±0.18＊＊ 1.93±0.43＊＊

讨 论

NTHi是儿童肺炎的常见病原之一，严重感染者可并发ESS。本研究证实NTHi肺炎小鼠血清T3与TSH水平降低，T4水平改变不具有统计学意义。以往的相关研究推测其发生机制与脱碘酶的活性改变有关［4］，但尚未验证此推断，且并未涉及脱碘酶量的改变。本研究证实感染后D3m RNA水平首先明显升高，TH的灭活增加，即T3水平首先迅速降低；随后D2mRNA水平升高，D3m RNA水平逐渐回落，感染后10d仍未至对照组水平，与之相对应的是TH的活化逐渐回升，即T3水平逐渐回升。

NTHi是常见的人体共生菌，多定植于鼻咽部。共生的平衡状态取决于宿主、微环境和微生物之间相互作用。一旦宿主、微环境和微生物之间平衡被打破，NTHi就从相对无害的共生菌变成致病菌，通过NTHi的粘附作用、诱导促炎因子释放、逃避宿主防御等致病。NTHi粘附于粘膜和细胞外基质的能力是其在特定宿主定植的前提；释放的游离脂寡糖是单核细胞释放炎症因子的强激活剂，介导细胞热休克蛋白表达、增加肺泡巨噬细胞肿瘤坏死因子－α的生成，使中性粒细胞迅速聚集引起宿主炎症反应，对肺部造成直接和间接损伤；同时NTHi通过多种机制来逃避宿主的防御，与机体处于共生状态，例如NTHi可产生三类Ig A蛋白酶，均从铰链区断裂Ig A重链［5］。

ESS的产生与早产、营养因素、各种损伤、心力衰竭、呼吸衰竭、营养不良以及肿瘤等有关，另外，外科手术后、糖尿病、结缔组织疾病等亦可致ESS［6］。

在急性炎症的动物模型中，D2活性上调，进一步研究证实，炎症所致的D2活性上调是通过c AMP途径的激活调节的［7］。

出生后绝大多数正常组织中D3m RNA的表达水平很低，但在多种疾病所致ESS D3m RNA表达重新被激活，从而降低T3水平，此现象提示了D3m RNA表达水平与ESS的相关性。D3mRNA的表达水平受多种因素调控，能被促红细胞生成素、表皮生长因子、酸性或碱性成纤维细胞生长因子、白细胞介素6等炎性因子诱导而增加其转录水平［8］。有研究证实急性细菌感染的小鼠模型中，被感染器官的中性粒细胞D3活性升高，T3水平显著减少；感染的野生型小鼠与D3基因敲除的小鼠白细胞介素6与肿瘤坏死因子－α均升高，二者差异无统计学意义；然而，与野生型小鼠相比，D3基因敲除的小鼠细菌数明显升高［9］。

D3m RNA表达水平于感染后迅速明显升高，可致感染后TH的灭活迅速增加，T3水平降低，从而降低代谢率与耗氧量，这一现象支持传统上认为的ESS时T3水平降低有利于能量平衡与减轻损伤。因此，有些学者认为，ESS的治疗就是对原发疾病的治疗，TH替代治疗对ESS病人是不需要的，人为给予TH治疗，提高血清TH水平到正常范围并不能改善ESS病人的预后，相反，人为地增加机体代谢，促使机体负氮平衡，增加心脏负荷，反而会使原发疾病恶化［10］。近年发现T3降低的非甲状腺疾病中都发现了细胞核T3受体的增多，即可能是机体组织受损的后果，故也有学者认为适时、适量、短期应用TH替代治疗可改善症状，减少并发症的发生，促进病情的恢复［11］。根据本研究结果，由于感染后D3m RNA水平升高，即TH灭活增加，对于NTHi肺炎并发的ESS TH替代治疗是否对局部TH水平有影响尚有待商榷，是否可改善预后尚有待进一步的研究及长期随访。

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Changes of type 2 and type 3 iodothyronine deiodinase mRNA in lungs of mice of NTHi pneumonia

Department of Endocrinology of Tianjin Children’s Hospital（Tianjin 300074）Shang Yueyun Huang Le Sun Guixiang et al

Objective：To explore the changes of T3，T4and TSH levels in serum and type 2 iodothyronine deiodinase（D2）and type 3 iodothyronine deiodinase（D3）m RNA levels in lungs of mice of nontypeable haernophilus influenza（NTHi）pneumonia，to speculate on mechanisms of pneumonia and euthyroid sick syndromes（ESS）and to provide theoretical basis to the treatment.Methods：C57BL／6 mice were randomly divided into control group，3 days after infection group，7 days after infection group and 10 days after infection group.Blood samples and lungs were taken 3，7 and 10 days after establishment of NTHi pneumonia model，T3，T4and TSH levels in serum were detected by radioimmunoassay method and D2and D3m RNA levels in lungs were measured by real time polymerase chain reaction（Real－time PCR）.The data were statistically analyzed by SPSS13.0 software package.Results：There were statistical differences of T3、TSH、D2and D3m RNA levels among the 4 groups（F＝47.129、9.028、16.600、10.505，while there was no statistical difference of T4levels among the 4 groups（F＝0.467）.T3and TSH levels of 3 days after infection group were lower than control group，and then picked up gradually，there was no statistical differences between 10 days after infection group and control group；correspondingly，D3level of 3 days after infection group was higher than control group and D2level of 7 days after infection group was higher than control group and then gradually dropped，but both were still higher than control group 10 days after infection，the differences were statistically significant.Conclusion：ESS may occur as complication of NTHi pneumonia and changes of D2and D3m RNA profiles involve in it.

Haemophilus influenzae／enzymology Pneumonia／immunology ＠Type 2 iodothyronine deiodinase ＠Type 3 iodothyronine deiodinase ＠Euthyroid sick syndromes Mice

流感嗜血菌／酶学 肺炎／免疫学 ＠2型脱碘酶 ＠3型脱碘酶 ＠非甲状腺疾病病态综合征 小鼠

R392.3

A

1000－7377（2012）03－0272－04

（收稿：2011－07－15）