姜黄素干预慢性应激大鼠体内皮质酮的动态变化和组织水平

费爱丽，张立康，胡国新，，李军伟，周红宇，

（温州医学院，浙江 温州 325035，1.药学院 药理教研室；2.分子药理毒理研究所）

姜黄素干预慢性应激大鼠体内皮质酮的动态变化和组织水平

费爱丽1，张立康1，胡国新1，2，李军伟2，周红宇1，2

（温州医学院，浙江 温州 325035，1.药学院 药理教研室；2.分子药理毒理研究所）

目的：研究慢性应激大鼠体内皮质酮（CORT）变化的动态规律和组织差异，观察姜黄素的干预特点。方法：束缚法建立大鼠慢性应激模型，姜黄素灌胃给药，研究体质量变化、旷场实验、血浆和组织中CORT水平。分别于束缚前、束缚后30、90、120、240和360 min连续取血。采用高效液相色谱法检测大鼠血浆与各组织中皮质酮水平。结果：慢性应激大鼠体质量增加缓慢，旷场实验中穿格数和直立次数减少，潜伏期延长，姜黄素不加快体质量增加，但可改善部分行为学指标。应激组大鼠第1天于束缚后30、90和120 min CORT水平持续升高，第7、第14和第21天仅在30 min时出现CORT水平升高，第1～第14天姜黄素不影响30 min的CORT高峰，但可加速CORT下降，且使基础状态组织内CORT浓度降低。结论：姜黄素不损害下丘脑-垂体-肾上腺轴的急性反应能力，但可阻止慢性应激时CORT的持续升高，且使脑、肝等组织局部CORT含量下降，此可能是其抗应激作用的基础。

姜黄素；应激；皮质酮；高效液相色谱；大鼠；动物模型

糖皮质激素为应激激素，在大鼠体内的活性形式是皮质酮（corticosterone，CORT）。慢性应激时CORT释放增加是诱发各种病理过程的重要因素。姜黄素（curcumin）是传统中药姜黄、莪术、郁金等的有效成分之一，可拮抗慢性应激所导致的CORT水平升高，从而防止其下游信息通路的过度激活[1-4]。但近年来，也有研究表明，抑郁、创伤后压力心理障碍症（PTSD）、糖尿病、慢性疲劳综合征和纤维肌痛等慢性应激相关的疾病存在CORT不足的情况[5]。那么姜黄素降低CORT水平的作用是否会造成机体在应激反应时CORT的不足呢？本研究检测了慢性应激大鼠接受束缚时血浆中CORT水平的动态变化和结束束缚后血浆及各组织中CORT的水平，观察长期给予姜黄素的干预效果，以全面阐述姜黄素对慢性应激大鼠血浆及靶组织中CORT水平的调节作用。

1 材料和方法

1.1 药物和试剂 姜黄素（sigma公司产品），C1386，用少量二甲基亚砜（DMSO）溶解后用玉米油配成5 mg·mL-1，灌胃给药。卡马西平标准品由中国药品生物制品检定所提供，批号：0142 9503。CORT标准品（Q1550-020，CAS50-22-6）和11-去氢皮质酮（11-dehydrocorticosterone，11-DHC。Q3690-000，CAS 72-23-1）标准品为美国steraloids公司产品。乙腈、三氟乙酸、乙酸乙酯等购自天津四友生物医学技术有限公司，一级色谱纯。乙醚为分析纯，宜兴市第二化学试剂厂产品。

1.2 实验动物 SD大鼠58只，雌雄各半，体质量180～220 g，清洁级，由温州医学院实验动物中心提供。动物合格证号：SYXR（浙）2010-0158。

1.3 仪器 高效液相色谱仪为美国Agilent1100系列，包括G1322A在线脱气机、G1311A四元泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315B二极管阵列检测器、Agilent化学工作站[RevA 08.03.（847）]。电子分析天平，组织匀浆机，涡旋混合器，水浴恒温振荡器，台式高速离心机，氮吹仪等。

1.4 大鼠慢性应激模型的建立 采用束缚法建立大鼠慢性应激模型。每天10:00-11:30给药，11:00-12:30用特制的大鼠固定器将大鼠束缚，至17:00-18:30解除束缚，连续21 d。

1.5 动物的分组、给药及取样 第一批大鼠40只，随机分为4组。对照（CON）组只给予玉米油灌胃，不予束缚；应激（STRESS）组玉米油灌胃+束缚360 min；低剂量（JHS10）组10 mg/mL姜黄素灌胃+束缚360 min；高剂量（JHS20）组20 mg/mL姜黄素+束缚360 min。每天灌胃后60 min束缚，连续21 d。记录大鼠体质量，于第22天进行旷场实验。每只大鼠旷场实验观察5 min自发活动后处死，取血、肝、肾上腺和脑组织，称重并测CORT含量。为避免糖皮质激素分泌的昼夜规律干扰，将大鼠束缚的起止日期错开，旷场实验和大鼠处死取样均控制在3 min内完成，在每天的13:00-15:00之间进行。

第二批大鼠18只，随机分为3组。对照（CON）组只给予玉米油灌胃；应激（STRESS）组玉米油灌胃+束缚360 min；给药（JHS10）组10 mg/mL姜黄素灌胃+束缚360 min。每天灌胃后60 min束缚，连续21 d。分别于第1天、第7天、第14天和第21天从尾静脉取血，取血时间为束缚前（记为0 min）、束缚30、90、120、240和360 min，每次取血0.3 mL。

1.6 旷场实验 旷场大小为100 cm×100 cm×50 cm，箱体黑色，底面用白线划分为25个面积相同的小格，沿墙格为外周格，其余为中央格，上方有摄像机。将大鼠置于中央格内，开始计时，观察并记录5 min内动物在中央格内的停留时间（潜伏期）、穿格数、直立次数、理毛次数和粪便数。

1.7 高效液相色谱法检测血浆和各组织的CORT水平

1.7.1 色谱条件：色谱柱为Agilent SB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；流动相为乙腈-水-0.1%三氟乙酸（31:29:40经15 min比例变为41:19:40）；流速为1 mL/min；柱温为25 ℃；检测波长为246 nm。

1.7.2 血浆及各组织样品的预处理：准确吸取待测血液样品0.3 mL于10 mL具塞试管中，加入20 μg/mL的卡马西平内标工作液50μL，混匀后加入0.01 mol/L盐酸溶液200μL。再加入乙酸乙酯3.0 mL，漩涡混匀2 min。静置10 min后转移上层有机相于另一刻度离心管中，氮吹仪中吹干。用200μL流动相复溶，取复溶液于自动进样器的样品瓶中，设定20μL进样检测。

取脑/肝/肾组织称重，按每0.1 g加入0.1 mL 0.9%氯化钠溶液匀浆，准确吸取0.3 mL匀浆于10 mL具塞试管中；肾上腺称重后按每16μg加入100μL 0.9%氯化钠溶液匀浆，准确吸取0.15 mL匀浆于10 mL具塞试管中。加入20μg/mL的卡马西平内标工作液50μL，混匀后加入0.01 mol/L盐酸溶液200μL。再加入乙酸乙酯3.0 mL，漩涡混匀2 min后3000 r/min离心，转移上层有机相于另一刻度离心管中，氮吹仪中吹干。用200μL流动相复溶，取复溶液于自动进样器的样品瓶中，设定20μL进样检测。

1.7.3 HPLC图和标准曲线：

标准品HPLC见图1。CORT的标准曲线为y2=0.9078x2+0.0016（r=0.9995，n=6，RSD=3.72%）；去氢皮质酮为y1=0.6309x1-0.0003（r=0.994，n=6，RSD=6.61%）。

图1 标准品HPLC图

1.8 统计学处理方法 采用SPSS13.0软件分析。大鼠体质量及血浆CORT水平的动态变化采用一般线性模型（GLM）的repeated measures和multivariate过程进行重复测量数据的多元方差分析；第21天血浆与各组织CORT水平的比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。根据方差齐性与否，分别采用LSD法或Games-Howell法进行两两比较。

2 结果

2.1 对大鼠慢性应激模型的评价 图2显示大鼠体质量的变化。第1天各组体质量无明显差异。第7、第14、第21天，CON组大鼠体质量迅速增加，而STRESS组大鼠体质量增加缓慢，两组之间差异有统计学意义（P＜0.01）。JHS10和JHS20组大鼠体质量增加缓慢，与CON组之间差异有统计学意义（P＜0.01），而与STRESS组之间差异无统计学意义（P＞0.05），提示姜黄素并不加快慢性应激大鼠的体质量增加。

图2 姜黄素对慢性应激大鼠体质量的影响

表1为大鼠自发活动的各项指标变化。与CON组相比，STRESS组大鼠潜伏期延长，穿格数和直立次数减少，而JHS10和JHS20组有明显改善。

表1 姜黄素对慢性应激大鼠自发活动的影响（n=10，±s）

表1 姜黄素对慢性应激大鼠自发活动的影响（n=10，±s）

与CON组比：aP<0.05，bP<0.01；与STRESS组比：cP<0.05，dP<0.01

组别CON STRESS JHS10 JHS20穿格数85.0±28.4 55.7±24.9a 85.7±43.0c 95.2±22.7d直立次数27.1±10.2 15.1±6.1b 18.0±8.1 24.3±9.6c理毛次数3.5±1.7 2.7±1.5 2.4±1.2 2.8±1.1粪便数1.7±1.1 1.0±1.2 0.9±1.1 1.4±2.1潜伏期5.4±2.4 13.1±6.6b 7.6±3.4d 7.3±1.8d

2.2 血浆CORT的动态变化 慢性应激大鼠血浆CORT水平的动态变化见图3-4。

图3为各组内不同时间点与束缚前（0 min）的比较。以每次束缚前的CORT浓度为基础水平，CON组第1、第7和第14天各时间点的CORT水平与基础水平相比差异均无统计学意义（P＞0.05），仅第21天240和360 min的CORT水平低于基础水平（P＜0.01或P＜0.05）；STRESS组第1天于束缚的30、90和120 min CORT水平持续高于基础水平（P＜0.01或P＜0.05），240和360 min时则降至基础水平以下（P＜0.01或P＜0.05），第7、第14和第21天则仅在30 min时出现CORT水平升高（P＜0.01或P＜0.05），个别持续至90 min（P＜0.01），后降至基础水平或以下，提示大鼠在急性应激时血浆CORT水平明显升高且可持续较长时间，但长期处于应激状态机体可能发生适应性调整，血浆CORT水平仅有短暂升高；JHS10组第1、第7和第14天于束缚的30 min出现CORT水平升高（P＜0.01），90 min即下降，240和360 min时可降至基础水平以下，第21天则无CORT上升高峰，且120 min时CORT即降至基础水平以下，即姜黄素连续给药1～14 d不抑制大鼠应激时血浆CORT高峰的出现，但可加速高峰后CORT水平的下降，缩短CORT在高浓度持续的时间，而连续给药达21 d时则完全抑制了应激大鼠血浆CORT高峰的出现。

图4为同一时间点各组间CORT浓度的比较。可见CON组、STRESS组和JHS10组的基础水平均无明显差异。与CON组相比，STRESS组在第1天束缚后30、90 min、第7天束缚后30 min、第14天束缚后30、90、120 min和第21天束缚后30、90、120 min均出现CORT水平明显升高，到束缚后240或360 min时各组CORT降至基础水平；JHS10组在第1天束缚后90、120 min、第7天束缚后120、240、360 min、第14天束缚后120、240 min和第21天束缚后30、90、120、240 min CORT水平均低于同一时间点的STRESS组水平，提示姜黄素可以阻止应激导致的血浆CORT水平升高。

图3 各组内不同时间点CORT浓度的动态变化

图4 在同一时间点各组间CORT浓度的比较

2.3 各组织CORT水平的改变 大鼠经21 d束缚后，第22天检测血浆及各组织的CORT水平，结果见表2。从表2可见，大鼠血浆CORT水平各组均无明显差异。肾组织中CORT水平亦无明显改变。脑和肝组织中，STRESS组的CORT水平与CON组相比均明显降低。而肾上腺组织中，STRESS组的CORT水平与CON组相比则明显升高。

表2 姜黄素对慢性应激大鼠血浆及各组织中CORT水平的影响（n=10，±s）

表2 姜黄素对慢性应激大鼠血浆及各组织中CORT水平的影响（n=10，±s）

与CON组比：aP＜0.05，bP＜0.01；与STRESS组比：cP＜0.05，dP＜0.01

血浆0.58±0.157 0.62±0.082 0.63±0.131 0.59±0.149组别CON STRESS JHS10 JHS20脑0.41±0.039 0.20±0.082b 0.23±0.077 0.06±0.02d肝脏0.32±0.134 0.17±0.080b 0.05±0.022c 0.05±0.013c肾上腺3.79±0.930 6.53±0.773b 5.66±1.180 6.02±1.786肾脏0.17±0.060 0.20±0.059 0.21±0.055 0.23±0.095

上述结果表明，不论是慢性应激还是姜黄素治疗，对于基础状态的血浆CORT水平均无影响；慢性应激可使肾上腺组织CORT水平增加，但同时脑和肝组织内CORT水平降低；姜黄素治疗不能纠正慢性应激引起的上述改变，反而使其脑和肝组织内CORT进一步降低，而肾上腺内CORT水平保持高于CON组的状态。

3 讨论

长期束缚是制备慢性应激模型的经典方法，通常以体质量变化和旷场实验作为评价模型是否成功的指标。慢性应激可导致大鼠体质量增加缓慢[6]和旷场行为[7]的改变，如探究行为减少和活动抑制[8]。本研究中，STRESS组和CON组相比，体质量增加缓慢，穿格数和直立次数减少，潜伏期延长，提示本研究采用的束缚方案可成功制备大鼠慢性应激模型；而姜黄素可增加束缚大鼠的穿格数和直立次数，缩短潜伏期，这与目前多数关于姜黄素抗抑郁作用的研究[9]结果一致。

应激状态时，下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴被激活，刺激肾上腺皮质合成和释放CORT。持续过多的CORT破坏细胞功能，引起多种病理改变，包括海马等脑组织损伤、胰岛素抵抗、骨质疏松、行为学改变等。但另一方面，机体应激时CORT增多，通过调节靶细胞代谢和协调机体各方面资源，使之适应应激状态，也是防止病理损害发生的重要途径。已有研究表明，许多与慢性应激有关的疾病是由于长期应激状态下CORT不足所致，如抑郁、PTSD、糖尿病、慢性疲劳综合征和纤维肌痛等[5]。

本研究中，笔者于大鼠束缚前及束缚后的30、90、120、240和360 min连续取血，研究大鼠束缚应激时血浆CORT水平的动态变化，结果发现，大鼠束缚30 min后即在血浆中出现CORT高峰，并持续至120～240 min，但随着束缚的连续进行，14 d后可发现CORT高峰持续时间缩短，至21 d时仅在30 min时出现高峰，反映出大鼠慢性应激时HPA逐渐耐受的过程（见图3）。通常这是由于下丘脑CRH释放过多，垂体CRH受体下调所致，可能也是许多慢性应激相关的疾病（如抑郁）同时存在CRH过多和CORT不足的原因。此外，各组大鼠束缚前血浆CORT水平各组间无明显差异，同样，第22天在大鼠不再接受束缚的情况下，血浆CORT水平各组间亦无差异（见表2），提示长期的束缚应激只减弱了HPA轴的急性反应能力，而并不影响其维持CORT基础水平的功能，但此时组织内CORT的水平却有明显差异。应激组大鼠肾上腺组织CORT水平高于对照组，脑和肝组织中CORT水平低于对照组，说明循环中CORT能够维持正常的基础水平是肾上腺、肝脏和脑组织共同调节的结果。肾上腺是合成CORT的部位，受HPA轴的调节，同时CORT对HPA轴亦有负反馈抑制。肝脏以表达1型11-类固醇脱氢酶（11β-HSD1）为主，介导无活性的11-DHC还原为有活性的CORT，是体内CORT再生的重要途径。脑内如海马等部位亦以表达11β-HSD1为主，催化还原反应，调控局部CORT水平，对维持CORT对HPA轴的负反馈抑制作用有重要意义。据文献报道，急性应激或给予CORT可使11β-HSD1活性增加，有助于应激反应时CORT水平的升高，慢性应激则使11β-HSD1活性下降，这反映了机体的自稳机制，可以防止长期持续的CORT过高带来的机体损伤[10-11]。而第22天JHS10组的检测结果（见表2）表明持续姜黄素治疗可使组织局部的CORT水平进一步降低，可能也是通过组织中11β-HSD1调节的结果，因为此时血浆CORT水平无明显改变，而肾上腺组织内的CORT水平是升高的。

姜黄素的抗应激作用已有大量研究证实，通常认为是抑制了应激所诱发的CORT增加，从而阻断了高浓度CORT引发的某些基因蛋白水平的改变，如糖皮质激素受体（GR）表达减少，脑源性神经营养因子（DBNF）表达减少，钙/钙调素激酶通路激活，N-甲基门冬氨酸受体（NMDA受体）表达增加等，因这些变化是介导慢性应激时靶组织损伤的重要途径[1-4]。而本研究结果证实，姜黄素可以防止慢性应激大鼠CORT水平的持续升高，同时又保持HPA轴的急性反应能力。从图3可见，给予10 mg/kg的姜黄素并不抑制大鼠束缚后30 min出现的CORT高峰，通过这种短暂的CORT升高来调节靶细胞的代谢水平，使机体适应应激状态，防止CORT不足造成的损伤。但JHS10组的CORT水平在高峰后即迅速下降，而不像STRESS组那样持续至120 min。CORT水平的及时下降，使血浆和靶组织CORT基础浓度维持正常甚至更低，阻断了慢性应激时持续高水平的CORT所引发的病理过程。上述JHS10组的CORT变化趋势一直保持到连续给药的第14天，直到第21天才没有出现明显的CORT高峰。由于HPA轴功能降低，CORT不足是慢性应激性疾病的另一重要原因，姜黄素用于抗应激治疗需要控制在一定的剂量和疗程内。

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The interventional effect of curcumin on the dynamic changes of blood corticosterone and tissue level in the chronic-stressed rat

FEI Aili*，ZHANG Likang，HU Guoxin，LI Junwei，ZHOU Hongyu.
*School of Pharmacy，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective:To study the dynamic changes of blood corticosterone(CORT)and tissue level in the chronic-stressed rat. and observe the interventional cbaracteristics of curcumin on them.Methods:Chronic stress was induced by immobilizing the rats for 6 h daily for 21 days. Body weight and open field test were evaluated to assess stress-induced functional changes. Corticosterone in blood and tissue was assayed with high performance liquid chromatography(HPLC). The blood were collected before restrained and when restrained for 30，90，120，240 and 360 min in day 1，7，14 and 21.Rats were executed and the brain，liver，adrenal，kidney and blood were collected in day 22 when rats were not restrained.Results:Chronic stress resulted in weight loss and behavior deficits in rats. Curcumin could attenuate behavior deficits induced by chronic stress. In day 1 the blood level of CORT was increased when restrained for 30，90 and 120 min，but in day 7，day 14 and day 21，the blood level of CORT was increased only at 30 min restrained. Curcumin could not eliminate the CORT peak at 30 min restrained，but decreased the blood CORT level at the subsequent time.Curcumin also decreased the CORT level in brain and liver in day 22 when the rats were no longer restrained.Conclusion:These results suggest that curcumin prevents against the persis-tent rise of CORT induced by chronic stress but don’t reduce the responsiveness of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis(HPA). The change of CORT level intervened by curcumin in our stress model helps to protect rats against chronic stress.

curcumin；stress；corticosterone；HPLC；rats；animal model

R335

A

1000-2138（2012）06-0511-06

2012-03-31

国家自然科学基金资助项目（81102092）；浙江省自然科学基金资助项目（LY12H31002）；温州市科技局国际合作项目（H20090024）。

费爱丽（1987-），女，浙江桐乡人，硕士生。通信作者：周红宇，副教授，Email：lxd54@163.com。

丁敏娇）

·论 著·