磷酸盐对大肠杆菌发酵异亮氨酸的影响*

孙家凯，吴晓娇，王晶，徐庆阳，谢希贤，陈宁

(天津科技大学生物工程学院，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津，300457)

L-异亮氨酸属于分支链氨基酸，是人体必需氨基酸之一，具有多种生理功能，广泛应用于医药、食品及其调味剂、动物饲料、化妆品的制造，尤其是在医学研究和治疗中的作用日益受到重视［1］。目前利用微生物生产L-异亮氨酸的方法主要有添加前体发酵法和直接发酵法。异亮氨酸产生菌大多由谷氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌及大肠杆菌选育而来。当前工业化生产中广泛应用的菌株为谷氨酸棒杆菌，但传统诱变育种获得的L-异亮氨酸高产菌株副生杂酸比较多，尤其是丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸等，这对后提取高纯度L-异亮氨酸造成很大的困难，同时由于发酵周期长(约70～96 h)，易染菌，从而使发酵成本增加，这也是异亮氨酸价格高昂的重要原因。由于大肠杆菌遗传背景清楚，繁殖迅速，培养代谢易于控制并且容易实现外源基因的高效表达，因此利用大肠杆菌构建能够生产异亮氨酸的基因工程菌具有广泛的应用前景。

磷酸盐既能够控制菌体的DNA、RNA和蛋白质的合成，也能控制糖的代谢作用、细胞的呼吸和胞内ATP水平［2］。磷酸盐的含量能够影响重组大肠杆菌表达质粒复制的速率，因而是菌体生长和目的蛋白表达量的决定性因素之一［3］。磷酸盐浓度能够影响大肠杆菌比生长速率，而乙酸的生成又与比生长速率息息相关，有害代谢物对重组菌存在抑制作用是影响大肠杆菌高密度发酵的重要因素，因此控制适宜的磷酸盐浓度对提高异亮氨酸产量具有重要意义。在前期实验以E.coli K12为出发菌株所构建的异亮氨酸工程菌的基础上，本文研究了磷酸盐对菌体生长、副产物生成、耗氨及产酸等影响，确定了L-异亮氨酸发酵过程中初始磷酸盐的浓度以及补加浓度，在达到高密度培养的同时实现L-异亮氨酸的增产。

1 材料和方法

1.1 菌株

E.coli TRFP，该菌株是以E.coli K12为出发菌株，经传统诱变选育得到SG及α-AB双重抗性突变株后，转化包含苏氨酸操纵子及苏氨酸脱水酶基因的表达质粒pthr101后而得到的L-异亮氨酸工程菌，由天津科技大学工业微生物菌种保藏室提供。

1.2 培养基

种子培养基(g/L):葡萄糖 30，酵母粉 10，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 5，KH2PO41，玉米浆20，氯霉素50 mg，pH 7.0 ～7.2，0.75 ×105Pa灭菌15 min。

发酵培养基(g/L):葡萄糖 30，(NH4)2SO44，微量元素混合液 5 mL，MgSO4·7H2O 1，KH2PO42，玉米浆 20，FeSO4·7H2O 100 mg，氯霉素 50 mg，pH 7.0～7.2，0.75×105Pa灭菌15 min。

1.3 培养方法

活化斜面培养:37℃恒温培养36 h。

5 L种子罐(上海保兴)培养:吸取适量无菌生理盐水于3支活化斜面中，将所有菌悬液接入装5 L种子罐中，初始装液量为3 L，初始通气量3 L/min;搅拌转速300～500 r/min;通过自动流加氨水控制pH值在7.0;培养温度37℃;以泡敌消泡;待种子培养液OD600为10～20时，按10%接种量接入发酵培养基中。

30 L发酵罐(上海保兴)发酵培养:按10%接种量将种子液接种于30 L发酵罐中，初始装液量为16 μL;初始通气量3 L/min;搅拌转速500 ～800 r/min;通过自动流加氨水控制pH值在7.0;培养温度37℃;以泡敌消泡;发酵时间34 h。

1.4 分析方法

菌体生物量及菌体比生长速率μ［4］:菌体生物量以菌体干重表示，取10 mL发酵液，10 000 r/min离心20 min，将菌体用蒸馏水洗涤2次后置于真空干燥箱中80℃干燥至恒重，用分析天平称重;菌体比生长速率μ定义为:单位质量菌体的瞬时增量，计算公式:

其中，X、x均为菌体量(g/L)，t为时间(h)，μ 为每克菌体在1 h内菌体增加的质量(g)，μ的单位为h－1。用Origin绘图软件对实验数据进行插值计算(时间间隔为0.1 h)，再用Excel软件求解不同时刻的μ。

L-异亮氨酸含量:采用高效液相分析系统测定。色谱分离条件:Agilent C18(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)，2，4-二硝基氟苯柱前衍生测定，乙腈与NaAc溶液进行梯度洗脱，柱温33℃，流动相流量1 mL/min，检测波长360 nm。

磷酸盐、乙酸及NH4+浓度:采用BioProfile 300A Nova(美国Nova Biomedical公司)生化分析仪测定。

2 结果与讨论

2.1 磷酸盐初始浓度对异亮氨酸分批发酵的影响

由表1可知，随着磷酸盐浓度的增加，最大比生长速率与生物量明显增加，但磷酸盐浓度在8～12 g/L时最大生物量却无明显变化，而高于12 g/L时反而下降，说明磷酸盐浓度过高后对菌体生长有一定的抑制作用。对于产酸而言，在磷酸盐浓度为4 g/L时得到最大产量，但与磷酸盐浓度为2 g/L时差别不大，且高于4 g/L后产量下降。可以看出，在一定范围内，随着磷酸盐浓度的增加产酸也相对增加，但过高后产酸呈现下降趋势。另外，磷酸盐初始浓度越大，菌体进入衰退期的时间越早，而发酵周期也越短。

表1 不同初始磷酸盐浓度对异亮氨酸发酵的影响

2.2 磷酸盐对比生长速率的影响

发酵过程中比生长速率μ是一个重要的参数，它能够影响细胞膜结构［6］、质粒的拷贝数、副产物乙酸的产生。在不同的比生长速率下，虽然mRNA数量无明显差异，核糖小体的数量却随着比生长速率的增大而增大，从而决定了细胞在高比生长速率下的蛋白合成能力更强［7］。而低比生长速率下能够有效地减少乙酸生成和降低耗氧速率，从而更容易达到高密度培养。因此发酵过程需控制适宜的比生长速率，在达到高密度发酵培养的同时实现异亮氨酸的高产。

图1 不同磷酸盐浓度下细菌比生长速率的变化曲线

由图1可知，发酵过程中，不同磷酸盐浓度下E.coli TRFC的比生长速率存在显著差异。随着磷酸盐浓度的增加，菌体的延滞期明显缩短，细胞比生长速率达到最大值的时间逐渐缩短。当磷酸盐浓度为8 g/L时，7 h达到最大值0.35/h，然后迅速降低，18 h左右进入稳定期。在较高磷酸盐浓度4 g/L与8 g/L时比生长速率差异较小，但前者的最大比生长速率较后者小，大约8 h达到最大值0.30/h，约22 h才进入稳定期。而在低磷酸盐浓度2 g/L与1 g/L时最大比生长速率差异较小(约0.27/h)，且两者达到最大比生长速率均在10 h之后，然后缓慢下降，但是磷酸盐浓度为1 g/L时，其延滞期最长，约4～5 h后才进入对数生长期，且其最大生物量也最小，如图2。由此可知，在高浓度磷酸盐条件下，虽然可以得到较大的生物量，但是其后期发酵无力，衰退较快。因此，需控制适当低的磷酸盐浓度(2～4 g/L)既保证得到较大生物量又能延缓衰退。

图2 不同磷酸盐浓度下生物量的变化曲线

2.3 磷酸盐补加对异亮氨酸发酵的影响

由L-异亮氨酸在磷酸盐2 g/L时发酵过程曲线(图3)可知，0～4 h为延滞期，4 h后进入对数生长期，16 h后既进入对数生长期后期，菌体生长明显减缓;而异亮氨酸从6 h开始积累，16 h后产酸趋势明显减缓，而此时发酵液中磷酸盐也几乎耗尽，后期发酵无力。因此通过补加2 g/L的磷酸盐以强化后期发酵。从图4可以看出，未添加磷酸盐时，25 h左右菌体进入稳定期，磷酸盐初始浓度为2 g/L与4 g/L时达到的最大生物量分别为31.9 g/L和36.5 g/L，而在对数生长期中后期添加一定浓度(2 g/L)的磷酸盐会发生二次生长现象，能够在一定程度上减缓菌体衰退，菌体22 h后才进行稳定期，且其最大生物量达到39.7 g/L，较前两者菌体生物量分别提高24.5%和8.7%。异亮氨酸产量也较前两者分别提高12.7%和9.2%。

图3 磷酸盐浓度为2 g/L时L-异亮氨酸发酵过程曲线

图4 添加2 g/L KH2PO4时对异亮氨酸发酵的影响

2.4 磷酸盐对副产物乙酸的影响

乙酸是大肠杆菌高密度培养过程中的主要的抑制性代谢副产物，发酵过程中乙酸的过多积累会导致菌体过早地衰老、自溶、比活性较低。高浓度的乙酸能减缓生长速率，能够在很大程度上降低补料分批培养中的生物量，乙酸的积累也是影响重组蛋白表达的重要因素［8］。Koh发现，乙酸对重组蛋白细胞的抑制作用比野生型细胞更为明显［9］;据报道［10］，乙酸浓度大于5 g/L时就能减缓生长速率，降低生物量，当培养液中乙酸浓度大于12 g/L时外源蛋白的表达完全被抑制。

图5 不同磷酸盐浓度下乙酸的变化曲线

由图5可知，在发酵初期，发酵液中几乎没有乙酸的积累，但是，在菌体进行对数生长期后，乙酸的积累均急剧增加，并且磷酸盐浓度越高积累的乙酸速度越快。其中，磷酸盐浓度为1 g/L和2 g/L时乙酸生成趋势大致相同。初始磷酸盐浓度分别为1 g/L、2 g/L、4 g/L和8 g/L时，积累乙酸的最大浓度依次为174.2 mmol/L、197.1 mmol/L、221.5 mmol/L 和239.8 mmol/L，这说明初始磷酸盐浓度越高，越容易积累高浓度的乙酸。另外当磷酸盐浓度低于4 g/L时，菌体进入稳定期后乙酸浓度均有不同程度的下降，而磷酸盐浓度为8 g/L时，后期乙酸浓度无明显下降，这可能是由于在较低的磷酸盐浓度下，发酵后期菌体活力相对较强，能够消耗一部分的乙酸，而高浓度的磷酸盐条件下后期发酵环境恶劣，菌体活力弱，对乙酸的耐受能力更差，因而菌体分解利用乙酸的能力较弱。

在大肠杆菌发酵过程中，乙酸产生主要有两个原因，即葡萄糖的摄入速率大于TCA循环的周转能力和通过呼吸链和氧化磷酸化的电子传递受到限制［11］。由图2可知，随着磷酸盐浓度的增加，发酵过程中菌体的最大比生长速率也相应增加。而在高比生长速率时，大肠杆菌仅靠氧化代谢不能提供足够的能量，必须通过乙酸生成途径储备ATP和NADH2以满足代谢能量需求［12］;同时当磷酸盐浓度增加时，糖酵解途径的活性大幅度提高，菌体利用葡萄糖的速率也相应增加。因此，在高磷酸盐浓度的情况下虽然具有较高的比生长速率，但是易产生大量副产物乙酸，而乙酸的积累影响生物量的进一步增加，同时外源基因的表达也受到严重影响。

2.5 磷酸盐对浓度的影响

大肠杆菌高密度发酵过程中，稳定的pH是保证菌体最佳生长状态的必要条件，代谢副产物乙酸和发酵产物异亮氨酸的积累，都会使发酵液的pH值下降，因而会消耗大量的氨水以维持pH的稳定，但是大肠杆菌对铵的利用能力有限，当浓度的增加至一定浓度后会对菌体产生毒害作用。Thompson认为浓度高于170 mmol/L时会抑制大肠杆菌的生长，浓度高于480 mmol/L时菌体的生长完全停止［13］。

图6 不同磷酸盐浓度下浓度的变化曲线

3 讨论

重组大肠杆菌的高密度发酵培养技术能够提高产物的比生产率，提高设备利用率从而降低生产成本。但是在该技术实际应用中却遭遇诸多问题，其中最为严重的就是培养过程中菌体过早地衰老和外源基因表达率低，这主要是由于有害代谢物对重组菌存在抑制作用。

将菌体的比生长速率控制在一定的阀值内，可有效减少乙酸的生成［15］，而利用大肠杆菌表达外源蛋白通常需要较高的比生长速率以获得高的表达水平［16］，因此可通过基因工程手段消除乙酸的产生。Cho等通过修改大肠杆菌染色体上mLc基因的启动子区域，从而使乙酸的产生降低了50%，而重组蛋白的表达量也大大提高［17］。Aristidou等通过表达枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶，从而将多余的丙酮酸转化成毒性较更小的副产物3-羟基丁酮，最终在将乙酸生成减少75%的同时，重组蛋白的表达量提高了两倍［18］。在发酵初期若磷酸盐过多，会导致前期菌体生长旺盛，后期发酵无力易衰退的现象，同时乙酸也会过多积累，而浓度随着乙酸浓度的增加而增加，两者相互影响，从而加剧菌体衰退。而细胞环境中浓度增加，降低了细胞对能量的利用效率，使细胞能量供应不足，导致细胞生长受阻，菌体生物量下降［19］。通过基因工程手段减少副产物乙酸的生成，然后提高发酵初期磷酸盐的浓度，从而提高发酵过程中的比生长速率，在得到较高的生物量的同时，实现外源蛋白的大量表达。

本文研究表明，在发酵初期降低磷酸盐浓度(KH2PO4浓度控制在2 g/L)，中后期补加2 g/L KH2PO4，可显著减缓菌体衰退，有效避免了高浓度磷酸盐条件下副产物乙酸的过多积累，明显提高了生物量和异亮氨酸的产量，这对工业化发酵生产L-异亮氨酸提供了理论依据并具有一定实用价值。

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